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摘 要

本文对课题组内已合成出的新型四价铂类-TDO抑制剂化合物TDOi-platin进行研究，通过各类方式评估其潜在的抗肿瘤活性。本文通过一系列的体外实验结果，如细胞凋亡实验、细胞周期实验、免疫荧光实验等，证明了TDOi-platin对于TDO过度表达的HepG2细胞系有良好的抗肿瘤活性。相较于传统的广谱抗癌药物顺铂而言，TDOi-platin的抗肿瘤活性高出了34倍。

通过进一步的体外细胞实验如Western Blot等，本文证实了TDOi-platin抗肿瘤的作用机制是通过化合物内TDO抑制剂来抑制癌细胞中TDO的表达，从而阻止犬尿氨酸（Kyn）的合成，并引发T细胞的增殖，从而引发了癌细胞的凋亡。

关键词：肝癌，铂类药物，免疫抑制剂

Abstract

The new compound TDOi-platin synthesized by our research group consists of a Pt(Ⅳ)-centered structure and a known TDO inhibitor, and its potential antitumor activity will be discussed in this thesis. The following study adopts several in vitro methods (such as Cell Apoptosis Analysis, Cell Cycle Analysis, Immunofluorescence, etc) proving that TDOi-platin owns potent antitumor activity against TDO-overexpressed HepG2 cancer cells. Compared with classical chemotherapy agent cisplatin, the antitumor activity of TDOi-platin is 34 times higher.

With further in vitro experiments like Western Blot, this thesis verifies the antitumor mechanism of TDOi-platin is to inhibit the TDO of cancer cells, block the production of kynurenine, and induce T-cell proliferation, which eventually leads to the apoptosis of cancer cells.

Keywords: Hepatocellular Carcinoma, platinum agents, immune inhibitors

目 录

摘要…………………………………………………………………………………………...…Ⅰ

Abstract…..………………………………………………………………………………...… Ⅱ

第一章 绪论 1

1.1肝癌 1

1.1.1概述 1

1.1.2非药物疗法 1

1.1.3临床药物治疗 2

1.2铂类药物 3

1.2.1顺铂及耐药性 3

1.2.2新型四价铂类药物 3

1.2.3多功能铂类药物 4

1.3免疫抑制剂 5

1.3.1肿瘤免疫机制 5

1.3.2PD-1/PD-L1通路 6

1.3.3CTLA-4通路 6

1.3.4IDO/TDO-KYN-AhR通路 7

1.4本文的研究目的和主要研究内容 8

第二章 实验方法 9

2.1细胞培育与处理 9

2.1.1细胞冻存 9

2.1.2细胞复苏 9

2.1.3细胞换液 9

2.1.4细胞传代 9

2.2细胞凋亡检测实验 10

2.3细胞周期检测实验 11

2.4AO/EB荧光染色实验 11

2.5Western Blot蛋白质免疫印迹实验 12

2.6细胞内犬尿氨酸含量测定 13

2.7小鼠模型体内抗肿瘤实验 13

第三章 实验结果 14

3.1细胞凋亡实验 14

3.2细胞周期检测实验 15

3.3AO/EB双染荧光检测实验 16

3.4蛋白质免疫印迹实验 17

第四章 结果与讨论 19

致 谢…………………………………………………………………………….......................21

参考文献……………………………………………………………………………………...…22

绪论

1.1肝癌

1.1.1概述

肝癌作为世界范围内第六高发的癌症，平均每年全球新增病例80万，致死率排名位列第二^[1]。并且大部分患者经诊断为肝癌时已经过于晚期无法进行外科手术移植方式来治疗。肝癌的发病率在不同地区有明显差异：多发于东亚、东南亚、北非和南非地区，在发展中国家尤为高发，其发病率较发达国家高85%之多^[2]。可以说肝癌的高发率和高致死率使得这一疾病依然是目前世界范围内十分棘手的疾病。而目前已有的化疗药物、靶向药物对肝癌的攻克依然有限，需要研究人员做更多层次与不同方向的深入研究，研究新型药物的新型作用机制，及其在体内体外的抗肿瘤活性。

主要的肝癌诱因为乙型肝炎、丙型肝炎或酒精引起的硬化，其他原因包括黄曲霉毒素、非酒精性脂肪肝和肝吸虫。肝癌分为原发性肝癌和继发性肝癌。原发性肝癌从肝部开始蔓延，而继发性肝癌可能会从身体的其他器官扩散至肝部，比较常见的情况包括胆管癌、乳腺癌、子宫癌、肺癌、胰腺癌的癌细胞经过扩散、至肝部后形成继发性肝癌。常见的原发性肝癌包括肝细胞型肝癌Hepatocellular Carcinoma（占肝癌的80%）、胆管细胞型肝癌Cholangio Carcinoma，较为罕见的则有粘液性囊性肿瘤Mucinous Cystic Neoplasm和胆道导管内乳头状肿瘤Intraductal Papillary Biliary Neoplasm。而本毕设所研究的四价铂类化合物TDOi-platin的抗肝癌效果，使用HepG2细胞系来验证体内体外的抗肿瘤效果，因此是特指对抗HepG2肝细胞型肝癌的抗肿瘤作用及机制研究。而在绪论部分即将展开讨论的抗肝癌药物的临床应用和现存瓶颈，也主要针对的是多发的肝细胞型肝癌（HCC）。

1.1.2非药物疗法

根据美国肝脏疾病研究协会和欧洲肝脏疾病研究协会发布的最新指导手册^[3][4]，目前临床上常使用的用于治疗肝细胞型肝癌的非手术局部疗法有肝动脉化疗栓塞术（TACE）、肝动脉放疗栓塞术（TARE）、射频消融术（RFA）、微波消融术等。大约50%的肝细胞肝癌患者会接受非手术型的化放疗治疗，但是抗肿瘤的效果会根据肿瘤组织大小和生长位置而有所差别。最常用的一般是射频消融术（RFA），并在肿瘤组织小于3ccm时可以结合以肝动脉化疗栓塞术（TACE）联合治疗。当病人保有正常肝功能且不适用于治疗性切除或消融手术时，一般采用动脉栓塞术进行治疗。而肝动脉放疗栓塞术（TARE）通常使用钇-90元素来进行治疗，被认为相比肝动脉化疗栓塞术（TACE）而言有更好的疗效。但是在临床双盲实验中，TARE与索拉菲尼相比，并没有能显著地提升晚期肝细胞型肝癌病人的存活率。因此常规的非药物治疗手段，在临床治疗中的真实抗肿瘤效果，依然需要更严谨的双盲临床试验去进行评判。

1.1.3临床药物治疗

目前治疗肝细胞型肝癌临床一线用药主要是靶向药物和免疫抑制剂。截止到2017年，索拉菲尼（Sorafenib）是唯一一款被FDA批准用于系统性治疗肝细胞性肝癌的药物。索拉菲尼是一款酪氨酸激酶抑制剂，可同时阻断RAF/MEK/ERK细胞信号传导通路以及血管内皮生长因子VEGF和血小板衍生因子PDGF，来发挥抗肿瘤作用。索拉菲尼在临床上可以将晚期肝细胞型肝癌患者的平均生存时间延长2.8个月^[5]。而乐伐替尼（Lenvatinib），一款与索拉菲尼药理作用类似的酪氨酸激酶受体抑制剂，因为在临床试验中并没有体现出优越性，因此在2018年被FDA批准为用于治疗肝细胞性肝癌化疗初治患者。

除了靶向药物，近几年新推入市场的免疫疗法和各种免疫抑制剂也被用于临床上的肝癌治疗。目前已经由FDA批准的、以及正在进行临床Ⅱ/Ⅲ期实验且有希望成功上市的可用于肝细胞性肝癌临床治疗的免疫抑制剂有PD-1抑制剂纳武单抗（Nivolumab）、CTLA4抑制剂替西利姆单抗（Tremelimumab）、PD-1抑制剂可瑞达Keytruda（Pembrolizumab）、PDL1抑制剂度伐单抗（Durvalumab）。

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