论文总字数：32636字

摘 要

本课题的创新点在于利用新型荧光母核：绿色荧光蛋白（GFP）的发光母核咪唑啉酮为母体，通过化学修饰，将其他荧光团以连接臂（包含识别基）的形式与母体连接，设计了一个能够对半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)以及谷胱甘肽(GSH)实现选择性识别的生物硫醇类荧光探针ML-FP。

在探针母核的活性甲基位置上引入吲哚吗啉基团，使其不仅具有溶酶体定位能力，而且荧光发射波长向长波方向移动。同时，利用2,4-二硝基苯磺酰氯作为识别基团，可以从荧光信号强度和响应时间上实现对Cys，Hcy及GSH三者的区分。通过滴定实验进一步证明了探针ML-FP的荧光信号强度与GSH和Cys的浓度具有线性相应关系，其检测限分别为4.39 µM和4.98 µM。除此之外，实验证明探针ML-FP能够在生理pH条件下稳定存在，因此可以应用于在人体中定量检测Cys和GSH。更重要的是，探针ML-FP具有良好的溶酶体定位能力并兼具良好的生物相容性，成功实现了活细胞内生物硫醇的内源性和外源性成像检测。

关键词：荧光蛋白，生物硫醇，溶酶体靶向，细胞成像

Abstract

The innovation of this subject is using imidazolinone (the luminescent core of GFP) as fluorescent nucleus. The fluorescent probe ML-FP was designed by combining other fluorophores with imidazolinone through chemical modification.Thus,it is able to recognize cysteine (Cys), homotype cysteine (Hcy) and glutathione (GSH).

The introduction of morpholine group makes the probe have not only the targeting ability for lysosomes but also a longer emission wavelength. At the same time,the probe take advantage of 2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride as the recognition group so that it can distinguish Cys, Hcy and GSH from other biothiols according to the fluorescent intensity and the response time. The titration experiments further prove that the fluorescent intensity of probe ML-FP has a linear correlation with the concentration of GSH and Cys, and the limit of detection (LOD) are 4.39 μM and 4.98 μM, respectively. In addition, since the probe ML-FP can stably exist under physiological pH conditions,it can be used to detect Cys and GSH in human cells quantitatively. What is more, the chromophore of the probe ML-FP has great biocompatibility and the ability to target lysosomes as well,so it has promising prospects in imaging and detection of endogenous and exogenous biothiol in living cells.

KEY WORDS:GFP,biothiol, lysosomal targeting, cell imaging

目 录

摘要 …………………………………………………………………………...…… Ⅰ

Abstract ……………………………………………………………………….……… Ⅱ

第一章 绪论...........................................................................................................................1

1.1引言 1

1.2常见的生物硫醇的检测方法 2

1.3荧光蛋白的发现及其发展过程 8

1.4本论文的选题依据以及研究内容 10

第二章 荧光蛋白分子ML-FP的多步构筑................................................................... 12

2.1引言 12

2.2实验部分 13

2.2.1主要试剂和药品 13

2.2.2主要仪器 13

2.2.3目标化合物ML-FP的设计、合成与表征 14

2.2.4 重要中间体的合成及表征 15

2.3结果与讨论 16

第三章 荧光蛋白分子ML-FP对生物硫醇的选择性识别及荧光成像 18

3.1引言 18

3.2实验部分 19

3.2.1溶液的配制 19

3.2.2检测限的测定 20

3.2.3细胞实验 20

3.2.4荧光量子产率的测定 20

3.3结果与讨论 21

3.3.1探针的基本光物理性质与选择性识别 21

3.3.2 探针ML-FP对GSH与Cys的定量检测 24

3.3.3探针在不同pH条件下的荧光信号响应 25

3.3.4溶酶体定位及活细胞成像实验 26

3.3.5识别机理 29

第四章 结论与展望 30

参考文献 32

致 谢 35

第一章 绪论

1.1引言

在生命体的细胞内含有大量活性含硫生物分子，包括硫化氢，二氧化硫，生物活性硫醇等等，它们参与并维持了生理平衡^{[1, 2]}，被统称为活性硫物种(Reactive sulfur species，RSS)。在生物体细胞中也分布着多种细胞器，主要包括中心体、叶绿体，高尔基体、核糖体、线粒体、溶酶体等，它们组成了细胞的基本结构，使细胞能正常地工作，运转。其中，溶酶体作为细胞的“消化器”，起着分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的重要功能。它的作用不仅局限于消化细胞自身的局部细胞质或细胞器，更重要的是，它可以分解从外界进入到细胞内的物质。可以看出，溶酶体作为真核细胞中一种非常重要的细胞器，对细胞的存亡有着特殊的意义。同时，溶酶体也是RSS的主要来源^[3]。

实际上人体内所含的生物活性硫醇种类繁多，包括各种氨基酸，酶，蛋白质等。作为细胞及有机体中重要的分子，RSS在损伤和氧化应激反应中作为抗氧化剂，金属螯合剂以及信使分子，在整个生理活动中扮演着重要角色。溶酶体内RSS对生命体的生理和病理过程都具有特殊的含义，如半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）、还原型谷胱甘肽（GSH）等，他们在调节生理环境和维持人体内氧化还原动态平衡过程中都起着不可或缺的作用^[4-8]。大量研究表明，RSS对生物体的作用具有双重性，适量的RSS对人体健康是有益的，但是当RSS过量或骤减时则会对细胞造成伤害，从而诱发心血管疾病以及神经退行性疾病，例如心脏病、动脉硬化、糖尿病、帕金森综合征等^{[3, 9]}。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：32636字