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摘 要

多发性骨髓瘤作为一种恶性浆细胞疾病，虽然药物治疗能够延长病人存活时间，但该疾病依旧无法被治愈。越来越多的研究表明，长链非编码RNA能通过不同的方式参与调控多种生物学进程，并且对肿瘤的发生发展也有着重要的影响。如今已经证实多发性骨髓瘤与长链非编码RNA相关。

本试验的目的是筛选出在多发性骨髓瘤细胞及其干细胞中表达有差异的lncRNA并对其作用机制进行研究。首先我们从文献报道中选出多种lncRNA，查询相关生物学信息，并设计相关引物。通过无血清饥饿培养法诱导出肿瘤干细胞，并通过CD138的表达量来验证诱导出来的细胞即为肿瘤干细胞。随后提取出正常人类细胞PBMC、多发性骨髓瘤细胞U266以及多发性骨髓瘤干细胞SC-U266的RNA，与之前设计的引物制备相应体系，通过普通PCR以及琼脂糖凝胶电泳实验定性地筛选出在三种细胞中差异表达的lncRNA。然后利用qPCR技术定量检测，进一步对lncRNA进行筛选。设计相关的siRNA，检测敲降效率，以备后续实验。

关键词：长链非编码RNA，多发性骨髓瘤，肿瘤干细胞

Abstract

Multiple myeloma is a malignant plasma cell disease. Although drug treatment can prolong patient survival, the disease still can’t be cured. More and more studies have shown that long non-coding RNA can participate in the regulation of various biological processes, and it also has an important influence on the occurrence and development of tumors. It has been demonstrated that multiple myeloma is associated with long non-coding RNA.

The purpose of this experiment is screening out the differentially expression of lncRNAs between multiple myeloma cells and their stem cells, and studying their mechanism of action. Firstly, a variety of lncRNAs are selected from literature reports, relevant biological information is searched for and related primers are designed. The cancer stem cells are induced by serum-free starvation culture. And it is verified that the induced cells are cancer stem cells by using the expression of CD138. Then, the RNAs are extracted form the normal human cells PBMC, multiple myeloma cells U266 and multiple myeloma stem cells SC-U266. The previously designed primers are used to prepare the corresponding system, and then the lncRNAs are qualitatively screened to find the lncRNAs which are differentially express in three types of cells by using RT-PCR and agarose gel electrophoresis experiments. Then the lncRNAs are further screened in the quantitative detection by using qPCR. The related siRNAs are designed to test the efficiency of knockdown for follow-up experiments.

KEY WORDS: long non-coding RNA, multiple myeloma, cancer stem cells

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1 多发性骨髓瘤 1

1.2 长链非编码RNA 1

1.2.1 信号分子作用 2

1.2.2 分子诱饵作用 2

1.2.3 引导功能 2

1.2.4 参与组成染色质支架 3

1.3 lncRNA在多发性骨髓瘤中的研究 3

第二章 试验材料 5

2.1 细胞株 5

2.2 主要试剂及设备 5

2.2.1 主要试剂 5

2.2.2 主要耗材和仪器设备 5

2.3 常用试剂配置 6

2.3.1 肿瘤细胞培养基 6

2.3.2 肿瘤干细胞培养基 6

2.3.3 PBS缓冲液 6

2.3.4 50×TAE电泳缓冲液 7

第三章 试验方法 8

3.1 细胞处理 8

3.1.1 细胞复苏 8

3.1.2 细胞传代 8

3.1.3 细胞冻存 8

3.1.4 细胞诱导 8

3.1.5 外周血单个核细胞的提取 8

3.1.6 细胞转染 9

3.2 RNA的提取及浓度测定 9

3.2.1 培养细胞总RNA的提取 9

3.2.2 RNA浓度的测定 9

3.3 PCR 10

3.3.1 逆转录PCR扩增 10

3.3.2 普通PCR扩增 10

3.3.3 实时荧光定量PCR扩增 10

3.4 琼脂糖琼脂电泳 11

第四章 实验结果 12

4.1 lncRNA的基本信息 12

4.2 引物设计 12

4.3 肿瘤干细胞的培养及鉴定 13

4.4 lncRNA的筛选及鉴定 15

4.4.1 lncRNA的定性筛选 15

4.4.2 lncRNA的定量检测 16

4.5 siRNA显著降低了U266细胞中82号lncRNA的表达量 17

第五章 讨论 18

第六章 结论 19

致 谢 20

参考文献 21

引言

癌症作为一种不治之症，已经带走了很多人的生命，是本世纪医学界急需攻克的难题之一。中国每年患癌死亡人数已经超过200万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。而作为遗传学研究的一个新方向，长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）近年来受到诸多关注，虽然lncRNA很多生物学功能及其机制尚不清楚，但其在多种肿瘤的发生发展中都发挥着重要的影响^[1]。随着相关研究的不断深入，lncRNA在多发性骨髓瘤发生发展过程中的作用机制也将会被阐明，为一些特异性表达的lncRNA作为临床诊断的标志物和治疗靶点提供研究方向^[2]。

多发性骨髓瘤

多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种恶性浆细胞克隆性增殖疾病, 是第二大最常见血液系统恶性肿瘤^[3-4]。多发性骨髓瘤的发病过程是多步骤的，早期染色体的易位导致部分基因（例如MMSET和FGFR3）的表达失调^[5]。随着病情的加重，染色体将再次易位，包括基因的激活（例如基因K-Ras和N-Ras等）、基因复杂的核型异常（例如基因c-Myc等）、突变（例如Tp53和Fgfr3等）等等^[6]。这些遗传学的异常导致恶性浆细胞的粘附分子表达发生改变，进而导致恶性浆细胞与骨髓基质细胞之间异常的相互作用，引起破骨细胞的活化和成骨细胞的抑制，导致溶骨性骨病变、贫血、免疫缺陷以及肾功能下降等等症状^[7-8]。

多发性骨髓瘤对各种细胞毒性药物普遍敏感，无论是在初发阶段还是复发阶段该疾病都能得到一定的治疗，尽管治疗效果短暂。然而在过去的几年中，随着相当一部分新药的研发，以及对骨髓微环境的深入理解，已经开始尝试新的治疗方法。治疗进展也很迅速，使病人的生存时间延长，生存期从3年增加到6年以上^[9]，但是多发性骨髓瘤在目前的治疗方法中仍然无法被治愈。

长链非编码RNA

自上世纪末开始实施人类基因组计划以来，我们在破译人类遗传信息的道路上不断前进着。随着2005年人类基因组计划测序工作的完成，大规模转录组研究的日益加深，我们对于遗传学的认识也在不断地被刷新，这对传统的中心法则提出了严峻的挑战。传统的中心法则认为，遗传信息转化为生物多样性的过程中，蛋白质才是行驶多种生物学功能的主体，而RNA只是作为DNA和蛋白质中介^[10-11]。过去对于癌症的发病机制研究大多集中在蛋白质编码基因的作用上。随着研究的不断深入，我们发现这些所谓的作为中介的RNA（mRNA等）只是RNA群体的一小部分，非编码RNA（noncoding RNA, ncRNA）是RNA群体中的一类重要组成部分^[12]。人类基因组计划测序的结果表明，生物学的多样性不仅仅受到蛋白质编码基因以及它们的剪接或翻译后的调控， ncRNA可能也参与其中，调控生物学的多样性。

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