论文总字数：28036字

摘 要

诱导含有天蓝色链霉菌的D-氨基酰化酶（Sco4986）基因的E.coli BL 21基因工程重组菌合成D-氨基酰化酶，然后特异性催化已消旋的N-乙酰-D,L-色氨酸中的N-乙酰-D-色氨酸生成D-色氨酸，再将未反应的N-乙酰-L-色氨酸进行消旋，通过循环往复的拆分实现D-色氨酸的大量生产。对基因工程重组菌进行了生长曲线的绘制，并选择最优生长时期进行诱导合成N-乙酰-D-色氨酸脱乙酰基酶（Natd），即D-氨基酰化酶。通过乙酸酐酰化L-色氨酸得到消旋后的N-乙酰-D,L-色氨酸。在不同pH环境、反应温度、反应时间的条件下，研究D-氨基酰化酶对N-乙酰-D,L-色氨酸的拆分，并得到反应最适pH、温度和时间。在最适pH、反应温度下对消旋液进行最适时间的拆分。从拆分液中分离出D-色氨酸，剩余液加酸酐重新进行消旋，然后再进行拆分，最终提高D-色氨酸产率。本实验最终结果显示，基因工程重组菌经培养4 h后添加IPTG诱导，所生成的Natd的酶促反应最佳条件为pH 7.5，反应温度37℃，反应时间至少40 min，且该酶的酶促催化效率可达71.8 % 。

关键词：D-色氨酸，D-氨基酰化酶，消旋，拆分

Abstract

The experiment induces the synthesis of D-aminoacylase from E.coli BL 21 genetically engineered recombinant bacteria which containing the D-aminoacylase (Sco4986) gene of Streptomyces coelicolor and then specifically catalyzes the production of D-tryptophan by N-acetyl-D-tryptophan in racemic N-acetyl-D,L-tryptophan. The unreacted N-acetyl-L-tryptophan is racemized, and mass production of D-tryptophan is achieved by repetitive resolution. The growth curve of the genetically engineered recombinant bacteria is plotted, and the optimal growth period is chosen to induce the synthesis of N-acyl-D-tryptophan deacylase (Natd), which also called D-aminoacylase. The racemic N-acetyl-D,L-tryptophan is obtained by acylating L-tryptophan with acetic anhydride. Under different conditions of pH, catalytic temperature and catalytic time, It studies the resolution of N-acetyl-D,L-tryptophan by D-aminoacylase and obtained the optimum pH, temperature and time of the reaction. The racemization solution is subjected to the optimum time resolution at the optimum pH and temperature. It separates the D-tryptophan from the resolving solution, and anhydrides the remaining solution again with acid anhydride, and then resolves to increase the D-tryptophan productivity. When it cultured for 4 hours, adding the IPTG induces genetically engineered recombinant bacteria to produce Natd, whose optimal conditions for enzymatic reaction are pH 7.5, catalytic temperature 37°C, which catalyzed at least 40 min. The final result of this experiment shows that the catalytic efficiency of the N-acyl-D-tryptophan deacylase can be as high as 71.8%.

KEY WORDS: D-tryptophan, D-aminoacylase, racemization, resolution

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 2

1.1 引言 2

1.2 D-色氨酸的研究现状 2

1.2.1 D-色氨酸的合成 2

1.2.2 D-色氨酸的应用 4

1.3 本文的研究目的和主要研究内容 6

1.3.1 研究目的 6

1.3.2 研究内容 6

第二章 实验设备及流程 7

2.1 实验材料 7

2.2 实验仪器 7

2.3 工艺流程 8

第三章 实验内容 9

3.1 N-乙酰-D,L-色氨酸的制备 9

3.1.1 L-色氨酸的消旋 9

3.1.2 N-乙酰-D,L-色氨酸的结晶 9

3.2 D-氨基酰化酶的制备及鉴定 10

3.2.1 基因工程重组菌的制备及其生长曲线的绘制 10

3.2.2 D-氨基酰化酶的诱导表达及电泳鉴定 12

3.3 N-乙酰-D,L色氨酸拆分及其条件的优化 16

3.3.1 D-氨基酰化酶的酶促催化反应条件优化 16

3.3.2 N-乙酰-D,L-色氨酸的拆分 17

3.4 D-色氨酸的分离和精制 17

3.4.1 色氨酸标准曲线的绘制 17

3.4.2 拆分液的阳离子交换层析 18

第四章 实验结果与讨论 21

4.1 基因工程重组菌的生长曲线 21

4.2 细胞培养液中D-氨基酰化酶电泳鉴定 22

4.3 Natd的酶促拆分最适条件 22

4.4 色氨酸标准曲线及拆分结果 23

第五章 总结与展望 26

致谢 27

参考文献 28

绪论

引言

D型氨基酸虽然存在于少数生物体内，但由于其非蛋白质氨基酸，因此一度未受到重视。随着近年来对于其相关功能的不断研究，D型氨基酸也愈加受到关注。D-色氨酸由于有着良好的抑菌效果等作用，在食品、医药等方面也得到了较为广泛的应用。然而其制备工艺不完善，不能大规模推广。

因此未来不仅需要对D-色氨酸相关代谢及作用机制进行研究，也需寻找和构建完善的合成和制备体系。其中通过发酵工程生产相关酶，再通过酶工程进行拆分生产D-色氨酸的技术有着很大的发展前景。而国内对D-氨基酰化酶的研究还处于基础阶段，商品酶仍需进口。

D-色氨酸的研究现状

色氨酸 ( Tryptophan，Trp ) ，又名β-吲哚基丙氨酸，分子式C11H12N2O2，分子量为204.23，是一种含有吲哚基团的中性芳香族氨基酸。根据其旋光性的不同，可分为L-色氨酸和D-色氨酸。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：28036字