论文总字数：47357字

摘 要

CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因修饰中起着越来越重要的作用。CRISPR相关蛋白Cas9核酸酶（CRISPR associated protein 9）可在特定的单向导RNA（single guide RNA,sgRNA）的引导下造成靶向位点的切割，使得基因组形成DNA双链断裂(DSB)。利用哺乳动物细胞中的同源末端修复（HDR）机制，可构建出用于下游功能研究的报告细胞系。利用这种特性,我们通过CRISPR-Cas9的方法构建出了带有OLIG2-EGFP和SOX10-mCherry荧光基团链接不同分化阶段少突胶质前体细胞特异标志物的干细胞系。在人干细胞中建立高效基因敲入技术，通过该项技术在移植人干细胞中装入活性调控原件使细胞分化和移植治疗达到最佳效果。首先我们构建PL552 OLIG2-P2A-EGFP PGK-pur和PL452 SOX10-P2A-mcherry PGK-neo作为donor plasmid。基于人胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）基因组中OLIG2和SOX10的序列信息，我们设计出分别靶向OLIG2和SOX10的Cas9-OLIG2-pre/post-sgRNA和Cas9-SOX10-pre/post-sgRNA，以及相应的test-sgRNA。我们用磷酸钙转染293T初步验证质粒表达，在结果符合预期的基础上电转ES,进行基因打靶。之后我们用抗生素筛选出整合了donor plasmid的细胞，并进行细胞克隆基因型鉴定，包括插入基因型鉴定和同源基因型鉴定。

最后,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑工具成功构建出了带有绿色荧光和红色荧光标记的少突胶质细胞报告系,为后续人胚胎干细胞定向分化成少突胶质细胞提供了有利的工具。

关键词：少突胶质细胞报告系，CRISPR/Cas9系统，OLIG2/SOX10，ES

Abstract

As a new gene editing tool, CRISPR/Cas9 technology plays an increasingly important role in gene modification. The CRISPR-associated Cas9 nuclease can cause the cleavage of the target site under the guidance of a specific single guide RNA (sgRNA), allowing the genome to form a DNA double-strand break (DSB). The homology-directed repair(HDR) mechanism in mammalian cells allows the construction of a reporter cell line for downstream functional studies. Using this property, we construct a stem cell line with OLIG2-EGFP and SOX10-mCherry linking different differentiation stages of oligodendrocyte precursor cell-specific markers by the CRISPR-Cas9 method. A highly efficient gene knock-in technique has been established in human stem cells, and this technology has enabled the differentiation and transplantation of human stem cells with active regulatory elements for optimal results. Firstly we construct PL552 OLIG2-P2A-EGFP PGK-pur and PL452 SOX10-P2A-mcherry PGK-neo as donor plasmids. According to the sequence information of OLIG2 and SOX10 in the human embryonic stem cell (ES) genome, we design Cas9-OLIG2-sgRNAs and Cas9-SOX10-sgRNAs targeting OLIG2 and SOX10, respectively, and the corresponding test-sgRNAs. We do calcium phosphate 293T cell transfection to verify the expression of the sgRNAs and then we electroporate the ES to target specific gene sites on the basis of the expected result of calcium phosphate 293T cell transfection. Afterwards, we use antibiotics to screen out the cells that integrated the donor plasmids, and then we perform cell clones genotyping,including insertion genotyping and homozygote genotyping.

Finally, we construct oligodendrocyte cell reporter line labeled with green fluorescence and red fluorescence using the CRISPR/Cas9 system succesfully, providing an advantageous tool for subsequent directed differentiation of human ES into oligodendrocytes.

KEY WORDS: oligodendrocyte cell reporter line, CRISPR/Cas9,OLIG2/SOX10,ES

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 0

第二章 实验材料及仪器 4

2.1 细胞系 4

2.2 菌种和质粒 4

1.3 免疫荧光染色相关试剂 4

1.4 细胞培养相关试剂 4

1.5 主要实验仪器 5

第三章 质粒的构建 5

3.1 donor plasmid的构建 5

3.1.1 PL552 OLIG22-P2A-EGFP PGK-pur的构建 5

3.1.2 PL452 sox10-P2A-mcherry PGK-neo的构建 8

3.2 sgRNA的构建 10

3.2.1 OLIG2基因位点特异性sgRNA序列的设计与合成 11

3.2.2 SOX10基因位点特异性sgRNA序列的设计与合成 11

3.3 test-sgRNA的构建 11

3.3.1 OLIG2-test-sgRNA与Cas9-test-sgRNA的构建 11

3.3.2 SOX10-test-sgRNA与Cas9-test-sgRNA的构建 11

第四章 磷酸钙转染293T细胞 11

4.1 293T细胞传代 11

4.2 磷酸钙转染 12

4.2.1 CCK-8检测PDK1抑制剂对细胞存活率的影响 12

4.3 荧光观察293T 12

第五章 ES细胞基因打靶 13

5.1 中抽提质粒 13

5.2 ES细胞培养 13

4.2.1 铺MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）六孔板 13

4.2.2 ES细胞传代 14

5.3 电转ES细胞 14

5.4 抗生素筛选阳性细胞克隆 15

5.5 刮取阳性细胞克隆 15

5.6 细胞克隆基因型鉴定（genotyping） 16

5.6.1 克隆基因组DNA抽提（genomic DNA extraction） 16

5.6.2 插入基因型鉴定（insertion genotyping） 16

5.6.3 同源基因型鉴定（homozygote genotyping） 17

第六章 数据处理与分析 17

6.1 PL552 olig2-P2A-EGFP PGK-pur PL452 SOX10-P2A-mcherry PGK-neo的构建 17

6.1.1 PL552 olig2-P2A-EGFP PGK-pur的构建 17

6.1.2 PL452 SOX10-P2A-mcherry PGK-neo的构建 19

6.2 Cas9-sgRNA的构建 21

6.2.1 BbsI酶切Cas9-sgRNA vector 21

6.2.2 设计靶向序列 21

6.2.3 连接Cas9 sgRNA vector与dsOligos，测序结果如下： 21

6.3 磷酸钙转染293T初步验证sgRNA是否起作用 22

6.3.1 观察报告基因EGFP在293T中的表达情况 22

6.3.2 sgRNA活性检测 22

6.4 PL552-OLIG2-P2A-EGFP-PGK-pur/PL452-SOX10-P2A-mcherry质粒电转ES细胞 23

6.4.1 puro/neo筛选阳性细胞克隆 23

6.4.2 OLIG2-SOX10位点基因型鉴定 23

结论 30

致 谢 30

参考文献 31

绪论

组成大脑的细胞包括胶质细胞和神经元，胶质细胞数量众多，约为神经元的10倍。中枢神经系统中胶质细胞包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。少突胶质细胞与神经元轴突外围髓鞘的形成和维持有关。两段髓鞘之间的部分称为郎飞氏结，它与神经电活动的跳跃式传导密切相关，显著加快了信息的传递。髓鞘化对于人类中枢神经系统的功能至关重要，若少突胶质细胞形成、分化或髓鞘形成和维持发生异常，在胚胎期或者幼儿早期就会表现出脱髓鞘疾病的表型，严重地影响人们的生活质量。长期以来，由于脱髓鞘疾病病因复杂、病变部位广泛、时间多发等因素，人们对于脱髓鞘疾病缺乏有效的治疗手段。目前的治疗方案多以缓解症状的对症处理为主，难以取得令人满意的疗效。人类多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSCs）包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs），是一类具有自我更新和无限分化潜能的细胞。在体外适当的培养条件下，hPSCs可以被大量扩增和分化为具有功能的少突胶质前体细胞，而后通过外源移植少突胶质前体细胞可以实现髓鞘的修复和再生，为脱髓鞘疾病的治疗提供一个新的思路。

1 髓鞘

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