论文总字数：33330字

摘 要

果蝇神经干细胞是一种多能干细胞，其经历多轮不对称分裂，一面实现自我更新，另一面产生的子细胞最终分化为神经元和神经胶质细胞，组成果蝇的中枢神经系统，控制果蝇的复杂行为。研究表明，神经元的产生是由于多种转录因子和神经元特异性基因按严格的时间顺序表达。其中，多种细胞命运决定因子及其他相关因子在调控神经干细胞功能中的作用已被阐明，但仍有许多因子的作用需要被不断探索。神经细胞粘附分子DNrx和DNlg主要在CNS和NMJs表达，其通过异嗜型结合，连接突触前膜和突触后膜，对突触结的装配、成熟及神经递质的传递至关重要。目前多研究DNrx和DNlg在突触发育中的作用，对其在调控神经干细胞功能方面没有涉足，故本课题利用UAS-RNAi果蝇和Grh-Gal4果蝇杂交产生的后代，分别特异性敲除其NBs中的DNrx和DNlg，探索DNrx和DNlg对果蝇NBs功能的调控作用。研究发现，Grhgt;dnrx RNAi、Grhgt;dnlg2 RNAi和Grhgt;dnlg4 RNAi果蝇中，NBs的子细胞GMC中可能存在一定程度的Mira和Pros共定位。这可能是由于Mira在GMC中没有发生正常降解。因此，果蝇DNrx、DNlg2、DNlg4可能对果蝇神经干细胞功能具有调控作用。而Grhgt;dnlg3 RNAi果蝇中，Mira可正常发生降解，DNlg3可能对果蝇神经干细胞功能无调控作用。此外，Grhgt;dnlg2 RNAi果蝇中，一个NBs产生的GMC谱系偏大，同时单个脑叶也较Grh-Gal4果蝇的大，说明DNlg2可能影响NBs的增殖能力。

关键词：神经干细胞、不对称分裂、突触、Neuroligin、Neurexin

Abstract

The Drosophila neural stem cell is a multipotent stem cell that undergoes multiple rounds of asymmetric division. One daughter cell achieves self-renewal, the other one eventually differentiates into neurons and glial cells, which together constitute the central nervous system that controls the complex behavior of the Drosophila. Studies have shown that the production of neurons is due to the strict temporal expression of multiple transcription factors and neuron-specific genes. Among them, the roles of various cell fate determinants and other related factors in the regulation of neural stem cell function has been elucidated. However, there are still many factors that need to be continuously explored. The neural adhesion molecules DNrx and DNlg are mainly expressed in the CNS and NMJs. Through heterophilic binding, the presynaptic membrane and the postsynaptic membrane are connected together, which is crucial for the assembly, maturation and neurotransmitter transmission of synapses. Currently the roles of DNrx and DNlg in the process of synapse development is well studied. But whether it is involved in regulating the function of NB is still unknown. Therefore, in this project we took advantage of Drosophila GAL4/UAS system to specifically knockdown DNrx or DNlg in NBs to explore the regulatory roles of DNrx and DNlg on Drosophila neural stem cell function. We found that in the Grhgt;dnrx RNAi, Grhgt;dnlg2 RNAi, and Grhgt;dnlg4 RNAi Drosaphila, Mira and Pros co-localized in GMCs, differentiated daughter cell of NBs, to some degree. This phenomenon might be due to the abnormal degradation of Mira in the GMC. In Grhgt;dnlg3 RNAi Drosaphila, Mira could be normally degraded, and DNlg3 may have no effect on the function of Drosophila NBs. In addition, in the Grhgt;dnlg2 RNAi Drosophila, increasing GMC was observed which resulted in significant larger brain lobe size than control, suggesting that DNlg2 might affect the proliferation of NBs.

KEY WORDS: Neuroblasts、Asymmetric division、Synapses、Neuroligin、Neurexin

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 前言 1

1.2 果蝇神经干细胞 1

1.2.1 果蝇的神经发生与NBs的不对称分裂 1

1.2.2 果蝇NBs不对称分裂机制 3

（1）极性轴的确定 3

（2）有丝分裂纺锤体的正确取向 4

（3）细胞命运决定因子在NBs分裂中的不对称定位 4

（4）细胞命运决定因子的差异分离 5

1.3 神经细胞粘附分子DNlg和DNrx 5

1.3.1 DNlg生物学特性 5

1.3.2 DNrx生物学特性 6

1.3.3 DNrx-DNlg信号通路 7

1.4 小结与展望 9

第二章 实验材料与方法 10

2.1 实验试剂与仪器 10

2.1.1 果蝇品系 10

2.1.2 试剂 10

2.1.3 仪器 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 果蝇的饲养 11

2.2.2 果蝇的杂交 11

2.2.3 果蝇三龄幼虫的解剖 11

2.2.4 免疫荧光染色 11

2.2.5 统计学分析 11

第三章 实验结果与分析 13

3.1 DNrx对果蝇神经干细胞功能的调控 13

3.2 DNlg对果蝇神经干细胞功能的调控 16

3.2.1 DNlg2对果蝇神经干细胞功能的调控 16

3.2.2 DNlg3对果蝇神经干细胞功能的调控 19

3.2.2 DNlg4对果蝇神经干细胞功能的调控 23

第四章 结论 27

致谢 28

参考文献 29

第一章 绪论

前言

大脑，一个神秘而又令人心驰神往的研究领域，即使近百年来科学家们对大脑的研究层层深入，但目前对大脑的了解仍然是冰山一角。大脑的形成归因于神经干细胞在空间和时间方向上增殖，大量不同的神经元协同控制着成年动物的复杂行为。但是，数量有限的神经干细胞是如何产生大脑中所有分化的神经元和神经胶质细胞的呢？一般而言，神经干细胞是通过在正确的时间表达特定的转录因子最终产生正确的神经元的。但是，由于哺乳动物大脑的发育时间长以及大脑本身的复杂性，使得对大脑的研究严重受阻。幸运的是，人类大脑发育过程中所有关键特征都可以在果蝇发育中的大脑中发现的神经母细胞中得到重现^[1]。得益于果蝇作为模式生物有许多优点以及果蝇的先进遗传工具，我们能够获得在脊椎动物模型中难以获得的对大脑的深入了解。

果蝇是目前一种非常常用的模式生物，其具有个体小，饲养方便，成本低，生命周期短，繁殖能力强，染色体数目少的优点，且其基因组测序已于2000年完成，遗传操作手段日渐成熟，突变体资源十分丰富，故其在发育及遗传研究中广受欢迎。目前研究果蝇基因/蛋白功能的常用方法是通过反向遗传学方法使表达某一功能蛋白的基因沉默，进而研究该基因的功能。主要技术有通过P因子转座、FLP/FRT系统以及UAS/ GAL4系统，UAS/GAL4系统是研究果蝇神经系统的常用方法。目前，已构成覆盖果蝇约90%基因的UAS-RNAi转基因果蝇库^[2,3]，利用UAS-RNAi果蝇以及特异的GAL4驱动子转基因果蝇可以组织特异性地敲除与果蝇神经干细胞不对称分裂相关基因，并进一步研究这些基因的具体功能^[4]。

果蝇神经干细胞

干细胞是一种具有自我更新能力和分化潜能的细胞，它在有机体的生长发育过程中起着相当重要的作用。生物体能够从一个受精卵发育至拥有各种组织器官的个体，正是由于干细胞的这种分化潜能。果蝇的神经干细胞，即神经母细胞（NBs），又称成神经细胞，是具有干细胞特性的果蝇神经前体细胞的一种^[3]，通过复杂的调控机制，果蝇NBs可不断自我更新及分化，最终形成果蝇的中枢神经系统，控制果蝇的一系列复杂的生命活动。下面将详细介绍果蝇的神经发生以及其中最引人注目的事件-NBs的不对称分裂。

果蝇的神经发生与NBs的不对称分裂

果蝇NBs通常在果蝇发育的胚胎时期形成，一直到果蝇进入蛹期时消失。在胚胎时期到蛹期这个阶段，NBs经历两次神经发生^[1,5]，均通过不对称分裂，一方面实现自我更新，另一方面产生的子细胞最终分化成为神经元和神经胶质细胞。在第一次神经发生时，NBs不对称分裂产生的全部神经元和神经胶质细胞共同组成幼虫的中枢神经系统（CNS）^[1]。幼虫的CNS不会保留至成年果蝇，其大部分神经细胞经历程序性细胞死亡而被清除，仅10％的细胞被保留^[1,6]。胚胎腹部区域的大多数NBs也会发生凋亡，而在头部和胸部区域，NBs进入休眠期，即从G1退出进入G0期。在幼虫孵化后约8-10小时，在一龄后期，NBs开始退出G0期并重新进入有丝分裂^[1,5]，这时即进入第二次神经发生阶段。

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