论文总字数：20697字

摘 要

目的：探究长寿相关基因SIRT2对抗病毒固有免疫的影响，为阐明衰老时固有免疫的变化提供初步的理论基础。

方法：用病毒刺激SIRT2敲低或过表达的细胞系，以qPCR及双荧光素酶检测细胞因子mRNA及蛋白水平上表达量的变化。在细胞中过表达SIRT2、SIRT2突变体、截短体及RLR（RIG-I like receptors）信号通路关键蛋白，通过双荧光素酶检测细胞因子的表达水平。统计相关参数并分析所得数据，说明SIRT2对抗病毒固有免疫特别是RLR通路的影响。

结果：在敲除SIRT2后细胞抗病毒能力明显增强，过表达SIRT2抑制病毒诱导的I型干扰素的产生。过表达SIRT2抑制RLR通路的重要识别受体MDA5（melanoma differentiation-associated gene-5）和RIG-I（retinoic acid-induced gene I）激活的免疫应答。在构建的SIRT2截短体中，包含核心催化区域及C端结构的截短体对MDA5激活免疫应答的抑制作用与野生型SIRT2最接近。无去乙酰化酶活性的SIRT2突变体N131A对MDA5激活免疫应答的抑制作用与野生型SIRT2相近。

结论： SIRT2可能通过作用于 MDA5和RIG-I抑制RLR信号通路的激活从而抑制病毒激活细胞因子的产生。SIRT2对RLR信号通路的抑制作用与C端结构域有关而与SIRT2的酶活无关。

关键词：SIRT2；抗病毒固有免疫；RLR通路

The Role of SIRT2 in Antiviral Innate Immunity

Student: Li Xueying Tutor: Qian Feng

Abstract

Objective: To investigate the effect of SIRT2 on the innate immune response of HEK293T cells and provide a preliminary theoretical basis for elucidating the changes of innate immunity in senescence.

Methods: The SIRT2 knockout HEK293T cell line and overexpression of SIRT2 cell line were treated with virus. qPCR and double-luciferase reporter are used to detect the expression of cytokines. The expression levels of cytokines were detected by double-luciferase reporter in HEK293T cells overexpressing SIRT2, SIRT2 mutants, SIRT2 truncation mutants and proteins in RLR (RIG-I like receptors) pathway. Statistical analysis of the relevant parameters will be used to indicate the effect of SIRT2 on innate immune response, especially RLR pathway.

Results: The anti-viral ability of the SIRT2 knockdown cells was significantly enhanced and overexpression of SIRT2 presents the opposite results. Overexpression fo SIRT2 inhibits the function of the important pattern recognition receptors MDA5 (melanoma differentiation-associated gene-5) and RIG-I (retinoic acid-induced gene I). The catalytic core of SIRT2 with the C-terminal domain has the closest inhibitory effect on the MDA5-activated immune response with wide-type SIRT2. The deacetylase activity dose not change the inhibitory effect of SIRT2.

Conclusion：SIRT2 might inhibit the production of viral activated cytokines by acting on MDA5 and RIG-I to inhibit the activation of RLR signaling pathways. The inhibitory effect is related to the catalytic core and the C-terminal domain and is independent of the enzyme activity of SIRT2.

Key words: SIRT2, antiviral innate immunity, RLR signaling

目 录

摘要 I

Abstract II

1 绪论 1

1.1 Sirtuins家族 1

1.1.1 Sirtuins家族简介 1

1.1.2 SIRT2分布 1

1.1.3 SIRT2生物学功能 1

1.1.3.1 SIRT2参与程序性坏死 1

1.1.3.2 SIRT2与神经退行性疾病 2

1.1.3.3 SIRT2与肿瘤 2

1.1.3.4 SIRT2与细胞稳态 3

1.1.4、展望 3

1.2 抗病毒固有免疫 3

1.2.1 抗病毒固有免疫简介 3

1.2.2 RLR信号通路 4

1.2.3 RLR信号通路的抑制 5

1.2.3.1 病毒对RLR信号通路的抑制 5

1.2.3.2 机体对RLR信号通路的抑制 5

2 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1细胞系 7

2.1.2主要试剂 7

2.1.3实验溶液 8

2.1.4实验仪器及设备 9

2.2 实验方法 9

2.2.1质粒构建 9

2.2.2实时荧光定量PCR 10

2.2.3细胞培养 11

2.2.4双荧光素酶报告基因检测实验 11

2.2.5 IFN-β生物学活性检测 12

3 结果与分析 13

3.1 敲低SIRT2提高细胞抗病毒能力 13

3.2 SIRT2抑制病毒诱导的IFN信号通路 13

3.3 SIRT2抑制RLR信号通路 14

3.4 SIRT2抑制MDA5和RIG-I的功能 15

3.5 SIRT2的C端结构域促进抑制细胞因子作用 16

3.6 SIRT2抑制细胞因子产生不依赖去乙酰化酶活性 17

3.7小结 18

参考文献(References) 20

致谢 22

1 绪论

1.1Sirtuins家族

1.1.1Sirtuins家族简介

Sirtuins蛋白质家族与酿酒酵母中沉默调控因子2（silent information regulator 2，Sir2）基因同源。Sir2是靶向组蛋白和非组蛋白的NAD 依赖的脱乙酰化酶，具有高度保守性。并且Sir2还具有单ADP核糖基转移酶活性。值得注意的是，Sir2的NAD 依赖性脱乙酰化与能量限制相关寿命延长相关。目前普遍认为sirtuins对于寿命延长可能不会起到决定性作用，但肯定在许多年龄相关疾病的各种机制，如应激反应调节、细胞凋亡和DNA修复中发挥着重要作用[^[1]]。

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