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摘 要

Dcn1在人类基因中是一种致癌基因，它与细胞有丝分裂周期有关，因此我们选择了裂殖酵母来研究它。要了解它的功能首先必须要提取出该基因所表达的蛋白，主要就是通过串联亲和纯化技术来分离纯化细胞天然状态下的蛋白Dcn1。该方法通过在目标蛋白上附加一个表位，该表位含有由特异性蛋白酶切割位点分开的两个不同的亲和标签（即：将构建的pFA6a–CTAP2–kanMX6质粒载体遗传转化酵母细胞，CTAP2通过同源重组结合到目标基因dcn1的C端）。 在两个连续的纯化步骤之后，将目标蛋白从细胞裂解液的总蛋白复合物洗脱。以便进行进一步研究。

关键词：裂殖酵母, dcn1基因, 串联亲和纯化技术, 基于pFA6a–kanMX6的TAP质粒载体(pFA6a–CTAP2–kanMX6)

Abstract

Dcn1 is a carcinogen in the human, which is related to the cell mitosis cycle, and so we chose the model eukaryote fission yeast to study it. To understand its function, the gene product Dcn1 protein, must first be extracted and purified. This study is mainly designed to extract Dcn1 protein in its native form using the tandem affinity purification technology (TAP). This method involves the addition of an epitope to the target protein containing two different affinity tags (pFA6a-CTAP2-kanMX6) separated by specific protease cleavage sites. After two successive purification steps, the target protein is eluted from the mixture of yeast cell lysates in its free or complex form, thus facilitating further investigation of the protein of interest.

KEY WORDS：fission yeast, dcn1(defective cullin neddylation 1)，Tandem affinity Purification (TAP)，pFA6a–CTAP2–kanMX6

目 录

绪 论 6

1.1裂殖酵母有丝分裂细胞周期 6

1.2 酵母有丝分裂相关蛋白Dcn1 8

1.3 TAP技术 9

1.3.1介绍 9

1.3.2理论 10

1.4 pEZZ18质粒 13

材料与方法 14

2.1 LB液体培养基的配制 14

2.2 构建pFA6a–CTAP2–kanMX6 14

2.2.1 pFA6a–kanMX6质粒DNA的扩增与提取 14

2.2.2 提取pEZZ18质粒 15

2.2.3 PCR扩增Protein A IgG结合结构域（ProtA）序列 15

2.2.4 凝胶电泳 16

2.2.5 割胶回收 17

2.2.6 在pFA6a–kanMX6质粒PacI和AscI限制酶位点处插入ProtA序列，构建pFA6a–ProtA-kanMX6质粒 17

2.2.7 在紧邻ProtA序列上游引入CBP（钙调蛋白结合肽）和TEV蛋白酶切割位点序列，构建pFA6a–CBP–TEV cleavage site–ProtA–kanMX6 (pFA6a–CTAP2–kanMX6) 18

实验结果 19

3.1引物设计结果 19

3.2 pFA6a-KanMX质粒转化大肠杆菌DH5α 19

3.3 PCR扩增ProtA IgG-binding domain 20

结 论 22

致 谢 23

参考文献 24

绪 论

目前，对真核细胞主要生命动的了解主要是通过几种生物体系的研究工作，包括酿酒酵母和裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe），作为细胞分裂和细胞周期研究中的经典实验材料,酵母具有其独特的优点，如容易培养，细胞周期短，易遗传，生化操作^[1]。 特别是两个酵母的基因组测序已经完成了多年，许多人类基因也可以在酵母中发现同源基因，这使得有可能在酵母中研究人类疾病相关基因同源物及其遗传调控的机制，因此酵母细胞周期研究引起研究人员广泛的兴趣。

1.1裂殖酵母有丝分裂细胞周期

上个世纪70年代，Paul Nurse等人以裂殖酵母为实验材料，发现了许多细胞周期调控基因，与另外两位科学家共享了2001年度诺贝尔生理学或医学奖^[2]。近年来，细胞周期调控最具突破性的进展是确立了调控细胞周期进程的分子机制。这一机制涉及细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)以及CDKs抑制蛋白(CDK inhibitors，CKIs)三种类型分子。CDKs作为催化亚单位，CDKs分子中Tyr、Thr残基的磷酸化与去磷酸化修饰决定了它的活性状态^[3]。细胞周期中不同时相的调节亚基--细胞周期蛋白与CDK瞬时结合成活化的细胞周期蛋白--CDKs复合物，构成细胞周期的“发动机”(cell cycle engine)。周期蛋白不但起激活CDK的作用，而且决定了CDK何时、何处、将何物磷酸化，从而推动细胞周期的进程。进一步的研究发现裂殖酵母cdc2 编码—个34KD的蛋白激酶Cdkl，可以促进细胞周期的进行。另外，细胞中CKIs还有对细胞周期起负调控作用。细胞在获得足够物质支持分裂以前，必须正常复制达到一定的体积的DNA，否则细胞不可以进行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为检验点(checkpoint)的严格监控下进行的，当DNA发生损坏、复制缺失或纺锤体形成异常时，细胞周期将被阻断。（图1）

图1.细胞周期运行示意图

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细胞周期检验点主要包括：①G₁/S检验点在酵母中称起点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G_l进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA有否损伤?细胞外环境是否合适?细胞体积是否足够大?②S期检验点：DNA复制是否完成?③G2/M检验点：这是决定细胞是否进入有丝分裂的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤?DNA复制是否结束?④中后期检验点：任意一个着丝点若没有正确无误连接到纺锤体上，都会抑制APC(anaphase promoting complex)的活性，导致细胞被阻断在有丝分裂中期。

DNA损伤检验点可以延迟细胞进入有丝分裂直到这些损伤的DNA被修复。在裂殖酵母中，DNA损伤主要发生在G₂/M转换的时期。蛋白Rads可以检查DNA是否受到损伤、复制是否结束，该蛋白包括Radl，Rad3，Rad9，Radl7，Rad26，Husl等。当细胞感应到DNA的损伤时，这些Rad蛋白可以将信号传递给激酶Chkl。蛋白激酶Chkl可以特异地行使这个阶段的检验点功能。酵母菌株缺失Chkl 基因时对DNA损伤药物不敏感，并且不能将这些带有损伤DNA的细胞阻断。Crb2蛋白和Chkl蛋白一样，是特异性的G₂DNA损伤检验点蛋白，并且在Rad蛋白的下游起作用。而这些G₂DNA损伤检验点蛋白最终的目标目标即为Cdc2蛋白。

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