论文总字数：17375字

摘 要

万古霉素作为应对由青霉素的广泛运用造成的大量产生青霉素抗性的革兰氏阳性细菌的最后防线，近年来的需求日益剧增。本文根据万古霉素的合成途径，对东方拟无枝酸菌ACL-1发酵生产万古霉素的工艺进行了优化。考察了温度、pH、搅拌、碳源、氮源以及万古霉素补料发酵工艺中补加葡萄糖的浓度及补料时间对万古霉素发酵的影响。结果表明：种子罐的最佳培养时间是20小时，种子罐的最佳培养温度是30℃，发酵罐的最佳pH为6.5，发酵罐的最佳转速在300rpm下，发酵罐的最佳碳源是葡萄糖15g/L和淀粉35g/L，最佳氮源是黄豆饼粉。采用优化后的发酵工艺并在发酵经行到40小时补入3%葡萄糖可以明显提高效价，其效价达到13.07g/L。

关键词：万古霉素；发酵优化；单因子实验；补料工艺

Abstract

Vancomycin, as the last defense to the large numbers of Gram positive bacteria of penicillion resistance by the wide use of penicillin, is demanded progressively in recent years. The process of the production of Vancomycin by the ferment of Amycolatopsis orientalis ACL-1 was investigated in several features of temperature, pH, stirring, carbon, nitrogen, and the addition of glucose concentrations and materials time in the process in this study.The results showed that the best time of original tank is 20 hours, the optimal cultivation temperature original tank is 30℃, the best pH is 6.5, the best speed fermenter is 300rpm, the best carbon fermenter is glucose 15g/L and starch 35g/L, the optimum nitrogen source is soybean flower. Using optimized fermentation process and adding 3% glucose at 40 hours can significantly improve the potency, which could reach at 13.07g/L.

Keywords: vancomycin；fermentationoPtimiziatio；Single factor experiment；feeding crafts

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 引 言 1

1.1 前言 1

1.2 万古霉素概述 1

1.2.1 化学结构及理化性质 1

1.2.2 临床药理作用 2

1.2.3 万古霉素的研究现状 3

1.2.4 万古霉素生物合成代谢途径 3

1.3 万古霉素的发酵工艺研究进展 4

1.3.1 种子罐最佳培养时间对万古霉素发酵的影响 4

1.3.2 温度对万古霉素发酵的影响 4

1.3.3 发酵液pH值对万古霉素发酵的影响 4

1.3.4 搅拌速率对万古霉素发酵的影响 4

1.3.5 碳源对万古霉素发酵的影响 5

1.3.6 氮源对万古霉素发酵的影响 5

1.3.7 补料的浓度和时间对万古霉素发酵的影响 5

1.4 本论文研究内容 6

第二章 实验操作方法 7

2.1 实验仪器 7

2.2 实验材料 7

2.2.1 菌种 7

2.2.2 实验发酵液培养基配比 7

2.3 实验操作方法 8

2.3.1 空气管路灭菌 8

2.3.2 种子罐的空消 8

2.3.3 pH的标定 9

2.3.4 种子罐的配料 9

2.3.5 种子罐的实消 9

2.3.6 溶氧电极的标定 9

2.3.7 接种 9

2.3.8 发酵罐的空消 10

2.3.9 发酵罐的配料 10

2.3.10 发酵罐的实消 10

2.3.11 移种管路灭菌及移种 10

2.3.12 实验数据记录 10

第三章 实验结果分析 12

3.1 单因子实验 12

3.1.1 种子罐最佳培养时间 12

3.1.2 种子罐最佳培养温度 12

3.1.3 发酵罐最佳培养pH 13

3.1.4 发酵罐最佳转速 14

3.1.5 发酵罐最佳碳源 15

3.1.6 发酵罐最佳氮源 15

3.2 补料工艺研究 16

3.3 万古霉素的测定 17

第四章 结果与讨论 20

4.1 实验总结 20

4.2 展望 20

致 谢 21

参考文献(references) 22

第一章 引 言

1.1 前言

从青霉素的广泛应用开始，抗生素的时代的来到了。但是随着青霉素的大量使用导致细菌产生了抗药性。万古霉素最初是由Mocormick等于1956年在印度尼西亚的土壤中分离得到的东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis发酵液中提取得到的抗革兰氏阳性菌的糖贰类抗生素。后来由Lilly公司进行研发。到后来的美国FDA批准上市以来，从最初的不被重视到后来的上世纪80年代由于青霉素的大量使用导致抗青霉素细菌的大量产生，而对耐青霉素的细菌有很好的疗效的万古霉素，才开始在临床中被大量的使用。而作为生物发酵类的药品生产最重要的一步就是其发酵过程，只有在发酵工艺中达到最高的效价才能确保在整个生产过程中达到最高的效益。^[1]由于万古霉素有较强的抑菌效果尤其是其在治疗MRSA等细菌及其对青霉素抗性菌的有效作用，因此被冠以Vanqulsh即征服之意。由于万古霉素最初产品纯度低,并且不易结晶提纯,于是在提取工艺上科研工作者进行了大量的研究工作,最终提取到盐酸万古霉素。最初形成的产品是Liny公司生产的“稳可信”,我国在90年代后由新昌药业最先引入万古霉素,从此弥补了我国这种抗生素的空白。

1.2 万古霉素概述

1.2.1 化学结构及理化性质

万古霉素属于糖肽类抗生素，由于在临床中应用的是万古霉素的盐酸盐，其分子式为C₆₆H₇₅Cl₂N₉O₂₄·HCl，分子量是1486。万古霉素是白色固体，极易溶于水，可溶于甲醇，不溶于高级醇类、乙醚和丙酮，低浓度的尿素可增加其在水中的溶解度。万古霉素分子由两个基本结构组成，即肽基部分的中心即七肽核结构和糖基部分α-o-vancosamine-β -o-glucosyl。万古霉素分子结构式如图1.1所示。^[2]

图1.1 万古霉素的分子结构式

1.2.2 临床药理作用

万古霉素的抗菌机理是通过干扰细菌细胞壁的合成和β-内酰胺类抗生素是相似的，两种抗生素的作用机理不同之处在于万古霉素只阻止革兰氏阳性细菌的细胞壁的合成。由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁的机理不同，所以万古霉素很少对革兰氏阴性菌产生作用。

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