论文总字数：29557字

摘 要

目的：通过基因工程技术构建高产丙酮醇的重组大肠杆菌，鉴定其利用甘油产丙酮醇的能力，并初步探讨辅酶NADPH和NADH对丙酮醇产量的影响。方法：利用P1噬菌体转导法敲除大肠杆菌Lin43中的pgi基因。同时利用沉默质粒pHN1009沉默gapA基因和过表达质粒pCA24N过表达yqhD 基因。将得到的重组菌进行静息细胞培养，测定胞内NADPH/NADP 和NADH/NAD 比值；用HPLC检测发酵液中产物和底物浓度。结果：敲除pgi基因后，NADPH/NADP 的比值与原始菌相比提高4倍，说明敲除pgi基因促进NADPH的再生。Lin43 Δpgi pHN1009-gapA菌株发酵后胞内NADPH/NADP 的比值最高，达到2.67，比单敲除pgi基因高1.2倍，同时丙酮醇的产量提高1倍，这表明NADPH的含量和丙酮醇产量正相关。过表达yqhD基因，丙酮醇产量增加2.6倍，而NADPH/NADP 的比值则下降为原来的83%，这说明NADPH被消耗，为丙酮醛转化为丙酮醇提供了还原能。敲除pgi基因，菌株的NADH/NAD 的比值提高1倍；沉默gapA基因，NADH/NAD 的比值下降为原来的29%。过表达yqhD基因对NADH含量的变化没有影响,推测NADH/NAD 的比值与丙酮醇产量相关性小。结论：本研究成功构建了重组大肠杆菌Lin43Δpgi pCA24N-yqhD pHN1009-gapA，丙酮醇产量达到为0.4 g/L，产率达0.1g/g。证实过表达yqhD可以增加丙酮醇产量，敲除pgi基因、沉默gapA基因可以通过增加NADPH含量，从而增加丙酮醇产量。为进一步构建高产丙酮醇大肠杆菌奠定了基础。

关键词：大肠杆菌Lin43，丙酮醇，pgi，yqhD，gapA，NADPH

PRODUCTION OF ACETOL FROM GLYCEROL

BY RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI LIN43

PAN Keli（41111102）

Abstract

Objective: To construct recombinant E. coli Lin43,which can efficiently convert glycerol into acetol, and explore the affect of NADH and NADPH on acetol production. Methods: In this study, the gene pgi in the strain Lin43 was deleted by P1 transduction. The yqhD gene was overexpressed by the plasmid pCA24N and the gapA gene was inhibited by the plasmid pHN1009. After the fermentation of recombinants as resting cells, the ratios of NADPH/NADP and NADH/NAD were measured. Besides, we used HPLC to indentify the main components in fermentation broth. Results: The ratio of NADPH/NADP increased 4 times after pgi deleted, which shows that the deletion of pgi and inhibition of gapA result in NADPH regeneration. The ratio of NADPH/NADP was 2.67 in Lin43 Δpgi pHN1009-gapA, which was 1.2 times higher than that of the only pgi knockout. Moreover, double increase of acetol production indicated the positive correlation between NADPH and acetol production. Overexpression of yqhD increased the acetol yield by 2.6 fold and reduced the ratio of NADPH/NADP by 80%，indicating that NADPH is consumed in the conversion of methylglyoxal to acetol. In addition, there has little correlation between the ratio of NADH/NAD and acetol production. Conclusion: This experiment has constructed recombinant E.coli Lin43Δpgi pCA24N-yqhD pHN1009-gapA, whose acetol yield reached 0.4 g/L. The deletion of pgi, inhibition of gapA and overexpression of yqhD all contributed to the efficient production of acetol. This work plays an important role in the future research.

KEY WORDS: E.coli Lin43, acetol, pgi, gapA, yqhD, NADPH regeneration

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪 论 1

1.1生物柴油副产物甘油的利用情况 1

1.2丙酮醇的应用与研究现状 1

1.3辅酶再生 2

1.4本文的研究目的和主要研究内容 3

第二章 高产丙酮醇的重组大肠杆菌的制备 6

2.1 前言 6

2.2 实验材料 6

2.2.1 菌株与质粒 6

2.2.2主要试剂和器材 7

2.2.3 培养基 8

2.3 实验方法 8

2.3.1 P1噬菌体转导法敲除基因 8

2.3.2利用热激法将外源质粒转入到大肠杆菌 9

2.4 实验结果 11

2.4.1 基因敲除结果 11

2.4.2 重组大肠杆菌的构建结果 11

2.5 本章小结 13

第三章 重组大肠杆菌NADPH再生及生产丙酮醇能力评估 14

3.1 前言 14

3.2 实验材料 14

3.2.1 菌株与质粒 14

3.2.2 主要试剂与器材 15

3.2.3培养基 16

3.3 实验方法 16

3.3.1 菌体生物质的获得 16

3.3.2将生物质作为静息细胞催化甘油产丙酮醇 17

3.3.3 提取NADPH/NADP 及测定^[24] 17

3.3.4 提取NADH/NAD 及测定^[25] 18

3.3.5 HPLC检测发酵产物 19

3.4 实验结果 19

3.4.1 NADPH/NADP 和NADH/NAD 检测结果 19

3.4.2 HPLC检测结果 21

3.5本章小结 25

第四章 结论 26

致谢 27

参考文献（References） 28

第一章 绪 论

1.1生物柴油副产物甘油的利用情况

进入 21 世纪以来，人类对能源的需求与日俱增，但由于石油资源的不可再生性和石化燃料燃烧造成的环境问题日益突出，寻求清洁的可再生能源将是未来能源发展的方向^[1]。在众多的能源替代品中，来自可再生植物油、动物油或餐饮废油的长链脂肪酸单烷基酯类生物柴油，由于具有无毒、燃烧完全、沸点较高不易挥发、能生物降解、润滑引擎、运输和储藏比石化柴油更安全等优点，受到了世界各国的关注^[2]。目前生物柴油生产工艺主要是采用化学催化转酯法，这种方法会产生大量的副产物——低纯度的甘油，一般每生产10吨生物柴油约产生 1 吨甘油^[3]。随着国际上生物柴油的需求和生产的快速增长，其主要副产品粗甘油大量产生，从而导致甘油供应严重过剩，价格大跌。因此，研究和开发利用生物柴油副产物甘油生产高附加值的新产品和新途径，成为降低生物柴油成本，延长生物柴油产业链，增强生物柴油的市场竞争力，支持生物柴油可持续发展的关键所在。

常用的将甘油转化为其他产物的方法可分为化学法和生物法两类^[4]。化学法需要在高温或高压条件下进行，并且转化率不高，容易对环境造成污染。而生物法转化甘油除了能克服化学法的这些缺点外，理论上还可以利用甘油分子比葡萄糖等常用碳源还原性更强的特点，更高效地利用厌氧发酵，生产出具有高还原性的产物。

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