甘露二糖-金纳米探针制备及与病毒受体DC-SIGNR的结合机制研究

论文总字数：29521字

摘 要

蛋白质-糖的多价相互作用能启动病原体与宿主的第一次接触，了解这些相互作用所涉及的结构和结合模式对于设计特定、有效的病毒抑制剂至关重要。C-型凝集素受体蛋白DC-SIGN和DC-SIGNR，可与病毒表面的多糖结合，诱发感染，但其识别区域的特殊四聚体空间排布尚不清楚。金纳米粒子作为纳米材料表面能量转移的受体，具有尺寸依赖且可调的荧光光谱、高的荧光量子效率和好的生物相容性。本项目设计制备了一种甘露二糖-金纳米探针，利用荧光共振能量转移，探讨了DC-SIGN/R的多价糖结合机制及两种蛋白的性质差异，为开发特异性多价抑制剂阻断DC-SIGN/R介导的病毒感染提供理论依据和实践指导。

关键词：甘露二糖-金纳米探针；多价结合机制；病毒受体蛋白DC-SIGN/R；荧光共振能量转移

Preparation of dimannose-gold nanoprobe and its interaction with protein

Abstract

Multivalent protein-carbohydrate interactions initiate the first contact between pathogen and host. Understanding the structures and binding modes used within these interactions plays an important role in the design of specific and potent virus inhibitors. C-Type lectin receptor proteins DC-SIGN and DC-SIGNR can bind to the glycans on the surface of virus and ultimately lead to infection. Unfortunately, their tetrameric spatial arrangements of carbohydrate recognition domains (CRD) are currently unknown. As the receptors of energy transfer on the surface of nanomaterials, gold nanoparticles have size dependent and adjustable fluorescence spectrum, high fluorescence quantum efficiency and excellent biocompatibility. In this paper, a novel dimannose-gold nanoprobe was designed and prepared. Fluorescent resonance energy transfer was used to reveal the multivalent glycan binding mechanisms of DC-SIGN/R and the differences between the two proteins. This work will provide a theoretical basis and practical guidance for developing specific multivalent inhibitors to block DC-SIGN/R mediated virus infections.

Keywords: dimannose-gold nanoprobe; multivalent binding mechanism; viral receptor

proteins DC-SIGN/R; fluorescent resonance energy transfer

目 录

摘　要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 蛋白质-碳水化合物的多价相互作用 1

1.2 C-型凝集素DC-SIGN/R 1

1.3 荧光半导体纳米材料 2

1.5 本文研究内容 3

第二章 甘露二糖金纳米探针的制备表征 4

2.1 甘露二糖-金纳米探针库的构建 4

2.2 实验内容 5

2.2.1 试剂和仪器 5

2.2.2 甘露二糖配体的合成 5

2.2.3 单链甘露二糖-金纳米探针的制备 14

2.2.4 双链甘露二糖-金纳米探针的制备 14

2.3 结果与讨论 16

2.4小结 17

第三章 病毒受体DC-SIGN/R的糖结合机制研究 18

3.1 前言 18

3.2 实验内容 18

3.3 结果与讨论 19

3.3.1 单链甘露二糖-金纳米探针与DC-SIGN/R猝灭实验 19

3.3.2 双链甘露二糖-金纳米探针与DC-SIGN/R猝灭实验 21

3.4小结 23

第四章 分子对接研究 24

4.1 前言 24

4.2 实验内容 24

4.3 结果与讨论 25

4.4 小结 26

第五章 结论与展望 27

5.1 结论 27

5.2 展望 27

本科期间发表的学术论文 28

致　谢 29

参考文献 30

第一章 文献综述

1.1 蛋白质-碳水化合物的多价相互作用

病毒的受体蛋白在许多病毒引起的疾病发作中起着关键作用，如人类免疫缺陷病毒（HIV）、埃博拉病毒和西尼罗病毒等，均由病毒表面糖蛋白驱动感染人体细胞从而致病^[1]。蛋白质-碳水化合物的多价相互作用（图1.1）可引发病原体和宿主细胞之间的第一次接触，这是导致病毒感染细胞的关键^[2]。阻止或抑制这些相互作用的分子能被用作进入抑制剂以预防此类接触感染。研究这些能产生相互作用的多聚体凝集素蛋白需要知道蛋白质与碳水化合物的结合位点、方向和间距，因此研究此类分子存在很大的挑战。同时这类作用在其他生物学事件，如细胞-细胞通讯、宿主免疫反应调节中同样重要，故近年来蛋白质-碳水化合物的多价相互作用研究广受学界关注^[3]。

图1.1 配体-受体的多价相互作用

Fig. 1.1 Multivalent interaction of ligand-receptor

1.2 C-型凝集素DC-SIGN/R

蛋白质-碳水化合物的相互作用在C-型凝集素中普遍存在。C-型凝集素是一类含有钙离子（Ca² ）依赖糖识别域（CRDs）的蛋白质超家族，可与多种病毒糖蛋白表面的糖结合，在许多重要的生物学过程，如先天免疫和血清糖蛋白清除中起着关键作用^[4]。2001年，Feinberg^[5]课题组在Science上报道了两种重要的C-型凝集素受体组成的II型膜蛋白——DC-SIGN^[6]（树突状细胞表面特异性细胞间黏附因子-3-结合非整合素因子）和DC-SIGNR^[7]（与DC-SIGN密切相关的内皮细胞受体）与寡糖结合的CRD晶体结构（图1.2）。两者对于含糖分子特别是甘露糖有很高的亲和力，如HIV和埃博拉病毒糖蛋白表面存在甘露糖，利用甘露糖吡喃环上的羟基与蛋白质的CRD结合，即可促进病毒感染。

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