人血清中定量检测赫赛汀生物类似药ELISA方法的建立

论文总字数：28120字

摘 要

随着治疗HER-2阳性乳腺癌的临床一线用药赫赛汀专利的到期，基于它的疗效和市场，全球各个药厂或生物公司争先仿制。而药物的上市申请，必须要有开展相关的临床实验和提供药物代谢动力学数据。由于赫赛汀生物类似药药代动力学十分复杂，常规方法难以形成全面，高灵敏的检测。依据相关申办方的合作要求及指导原则 《9012 生物样品定量分析方法验证指导原则》，中华人民共和国药典(五部)，本研究将为其建立人血清中定量检测赫赛汀生物类似药的ELISA方法（酶联免疫吸附法），为其开展的临床试验和药物代谢动力学提供检测技术支持。

方法学验证表明ELISA法测定人血清中赫赛汀生物类似药浓度的本方法经验证的定量范围为62.5～4000.0 ng/mL。批内和批间的精密度都低于10%，且准确度在88.4%～111.3%范围内，特异性，选择性，稀释线性均满足新生物制药临床前药代动力学研究指导原则要求，可用于赫赛汀生物类似药的检测。

关键词：赫赛汀，人表皮生长因子受体-2（HER-2），ELISA法，药物代谢动力学

Establishment of a ELISA method for quantitativedetermination of Herceptin Biological analogues in Human Serum

Abstract

With the expiration of the patent for Herceptin, a first-line clinical drug for HER-2-positive breast cancer, manufacturers or biotech companies around the world are scrambling to replicate it based on its efficacy and market. For drug listing, it is necessary to carry out clinical trials and provide pharmacokinetic data. Due to the complex pharmacokinetics of Herceptin biological analogues, it is difficult for routine methods to form a comprehensive and highly sensitive assay. In accordance with the cooperation requirements and guiding principles of relevant sponsors, "9012 guidelines for validation of quantitative analysis of biological samples", Pharmacopoeia of the people"s Republic of China (five parts), This study will establish a "ELISA method for the quantitative detection of Herceptin biological analogues in human serum", and provide technical support for its clinical trials and pharmacokinetics. Methodological verification showed that the quantitative range of this method for the determination of Herceptin bioanalogues in human serum by ELISA was 62.5～4000.0 ng/mL.. The intra-and inter-assay precision was less than 10%, and the accuracy was in the range of 88.4%～111.3%. The linearity of specificity, selectivity and dilution met the requirements of the preclinical pharmacokinetic study of new biopharmaceutical. It can be used to detect the biological analogues of Herceptin.

Key words: Herceptin, human epidermal growth factor receptor-2（HER-2）, enzyme linked immunosorbent assay (Elisa),pharmacokinetic

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 引 言 1

1.1 HER-2的阳性表达与肿瘤 1

1.2 赫赛汀及其生物类似药治疗HER-2过度表达癌症的作用机制 1

1.3 赫赛汀生物类似药的市场现状分析及立项依据 1

1.4 检测方法的选择 1

1.5 方法类型的选择 2

1.5.1间接法 2

1.5.2竞争法（测抗体） 2

1.5.3捕获法 2

1.5.4夹心法（双抗体夹心法） 2

1.6 小结 2

第二章 方法建立 3

2.1 试验原理 3

2.2 试剂 3

2.2.1 标准品 3

2.2.2 非关键试剂 4

2.3 材料及设备 4

2.4标准曲线样品（STD）的配制 4

2.5 质控样品(QC) 的配制 5

2.6 溶液的配制 6

2.6.1 包被缓冲液 (1×PBS) 6

2.6.2 5M HCl溶液 6

2.6.3 5M NaOH溶液 6

2.6.4 300 mM醋酸溶液 (pH=2.0±0.1) 6

2.6.5 中和缓冲液 (pH=8.5±0.1) 6

2.6.6 洗涤缓冲液 (PBST) 6

2.6.7 样品稀释液A 6

2.6.8 样品稀释液（封闭液） 7

2.6.9 终止液 (4 N H₂SO₄) 7

2.6.10 TMB底物溶液 7

2.6.11 混合健康人血清/基质 7

2.7 拟定试验步骤 7

2.8 工作溶液浓度的确定 7

2.8.1 确定试验1（以ATA浓度为定量） 7

2.8.2 确定试验2（以HER-2浓度为定量） 9

2.8.3 确定试验3（观察质控样品回归情况） 11

2.9 最终确定试验方法 15

第三章 方法验证 17

3.1 接受标准 17

3.1.1标准曲线接受标准 17

3.1.2质控样品接受标准 (适用于除精密度、准确度验证试验和其它验证性试验之外的批次试验) 17

3.1.3未知样品接受标准 17

3.1.4其它验证性试验 17

3.2标准曲线与定量范围 18

3.2.1 目的 18

3.2.2 试验结果 18

3.2 准确度和精密度 18

3.2.1 目的 18

3.2.2 试验结果 19

3.3 选择性 20

3.3.1 目的 20

3.3.2 试验结果 20

3.4 稀释线性与“钩状”效应 21

3.4.1 目的 21

3.4.2 试验结果 22

3.5 短期稳定性 22

3.5.1 目的 22

3.5.2 试验结果 23

3.6 长期稳定性 23

第四章 结论 24

第五章 谢辞 26

第六章 参考文献 27

第七章 附录 28

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