丹磺酰氯的合成工艺

论文总字数：14022字

摘 要

将1-氨基-5萘磺酸和硫酸二甲酯为原料在5摄氏度进行6小时的甲基化反应，得到产品N,N-二甲氨基-5-萘磺酸，再将其与五氯化磷进行2小时的研磨反应，乙醚萃取，得到产品丹磺酰氯；通过合成丹酰氯的荧光单体硅酯前驱物，采用油包水的反相微乳液法，以丹酰氯的荧光单体硅酯前驱物为核材料，成功地制备了丹酰氯的荧光纳米颗粒，解决了传统工艺制备核壳荧光纳米颗粒中的荧光染料泄漏问题。

关键词：丹磺酰氯；1-氨基-5萘磺酸；合成；微乳液

Abstract: N,N-1-Dimethylamino-5-naphthalene sulfonic acid was synthesized from 1-amino-5-naphthalene sulfonic acid and dimethyl sulfate react 6 h at 5℃ by dimethy lation, then react with PC l5 for 2 h, extracted with dry ether, dansyl chloride was obtained. Of dansyl chloride fluorescent monomer silicon ester synthesis precursors, using the inverse of water-in-oil microemulsion method, fluorescent monomer with dansyl chloride silicone ester precursors for nuclear materials, dansyl chloride was prepared successfully fluorescent nanoparticles.

Keywords: dansyl chloride, N,N-1-dimethylamino-5-naphthalene sulfonic acid, synthesis, water-in-oil microemulsion

目 录

1前言 6

2实验部分 11

2.1丹磺酰氯的特性 11

2.2实验原料及试剂 11

2.3实验仪器及设备 12

2.4丹磺酰氯的合成 13

2.4.1 N,N-二甲氨基-5-萘磺酸的合成 13

2.4.2合成丹磺酰氯 13

2.5丹磺酰氯烯丙基胺的合成 13

2.6丹酰氯SiO2纳米发光标记物的制备 14

2.6.1荧光单体硅酯前驱物的制备 14

2.6.2荧光纳米颗粒的制备 14

2.6.3染料泄漏实验 14

2.6.4 pH值对样品荧光性质的影响 15

3结果与讨论 15

3.1 1-氨基-5-萘磺酸的二甲基化 15

3.2 N,N-二甲氨基-5-萘磺酸磺酰化合成丹磺酰氯 15

3.3丹磺酰氯与烯丙基胺的酰胺化反应 16

3.4影响荧光单体前驱物的形成因素 16

3.5荧光纳米颗粒的光谱特征 16

3.6 pH值对磺酰胺基类化合物及纳米颗粒荧光性质的影响 17

4研磨反应机理及影响因素 17

5碳酸二甲酯甲基化反应催化剂和反应机理 17

5.1碳酸二甲酯作为甲基化试剂的理论基础 18

5.2催化剂的种类 18

结论 20

文献参考 21

致谢 23

1 前言

目前世界上各个国家的研究人员正把研究的方向放在高灵敏度非同位素检测法的研究上，高灵敏度非同位素检测法的发展和运用极具意义，对于促进生命科学、现代分子生物学甚至医学的发展有着重要作用。众所周知，现阶段，人们对于上述两种科学的研究和发展上还仍处于比较表层的阶段，例如对于现代分子生物学的研究，人们还仅仅停留在细胞水平的研究上，而要想更深入的分析和研究则需要更好、更有效的方法。标记分析法是主要用于生物大分子检测的主要方法，其中应用最多也是最主要的方法是发光标记，对灵敏度检测有较大影响的因素主要有标记物的发光强度与稳定性。在此方法中，染料的选择是一个重要的环节，过去所使用的有机染料由于自身某些性质原因存在着诸多问题，从而使得有机染料无法被广泛的运用于生物大分子的检测领域。为此，人们研究出了荧光染料一种新型的染料以代替过去使用的有机染料，荧光染料不仅具有低背景和良好光稳定性，而且还具有光量子产率高的特点，这种新型染料的出现势必会大大促进生物学的发展。

荧光标记技术是指利用一些能发荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记技术最早出现于上世纪四十年代，最初是用于医学领域的研究和分析，人们为了能够有效的利用抗体检测出相应的抗原研究并发展了这一项技术。随着现代科学的进步，越来越多的先进检测仪器被研究制造，越来越多的检测技术被研究利用，仪器上的越来越先进和技术上的越来越成熟多样又大大促进了现代医学、分子生物学的发展，为此，荧光标记技术被越来越多的应用到了现代医学和分子生物学领域。

荧光标记试剂被认为是在化学反应中与无荧光的化合物之间形成化学键的物质，是提供荧光体的试剂。荧光素类和罗丹明类在荧光标记技术中是很常用的荧光标记试剂，另外还有一些其它的例如芳香杂环化物类也是比较常见，虽说种类很多，但人们为了追求效果更好的的荧光标记试剂正在不断地努力着，因此新型荧光标记试剂的研究正不断的进行，正是由于研究人员的探索和创新精神，使得越来越多的新型荧光标记试剂得以开发运用。

有机染料作为传统染料在荧光标记物领域中占据着重要地位，虽然它存在着很多短处和不足，在有些领域无法发挥作用，但有机染料的出现在推动生命科学以及医学的发展上还是做出了巨大贡献。科研人员对效果更好的方法的追求脚步永远不会停止，人们在生物学以及医学研究中发现传统荧光分析方法存在着很多不足，无法完全满足研究中的需求，为了避免这些问题，研究人员将荧光染料制成了荧光纳米颗粒。由于受某些条件所限，现阶段人们研究的核壳型包覆的纳米颗粒荧光材料主要局限在一些金属配合物范围内。荧光染料泄漏问题一直是备受研究人员关注的一个问题，这一问题在核壳荧光纳米颗粒的过程中普遍存在，而这一问题的存在也成为了有机荧光标记试剂无法用于核壳型纳米颗粒的主要原因。为了克服这一问题，人们用羊抗人免疫球蛋白(IgG)标记的异硫氰酸荧光素(FITC)为核材料制备荧光纳米颗粒，事实证明此方法相比于传统方法在避免染料泄露上确实起到了一定的效果，但由于羊抗人免疫球蛋白的成本过高，因此这种方法也没有得到人们普遍青睐。为此，本文介绍了一种新方法以用于包埋有机荧光染料，这种新型的具有高灵敏度的非同位素检测标记物的出现又为生物医学研究领域提供另一种选择。

荧光微球被定义为微球的表面标有荧光物质或微球体内结构含有荧光物质的功能性微球，外形多变，一般为球形。在受到外界能量的刺激下能激发出荧光。目前，随着科学技术的进步，荧光探针技术也在不断地成熟和完善，对于荧光微球的制备，人们已具备了一套成熟和完善的技术体系，在制备不同大小粒径的荧光微球时都能熟练操作、成功制备。荧光微球之所以能越来越多的运用于各个领域，一个重要原因就是它具有更加稳定的形态结构，外界环境的影响是不可忽略的，而稳定的形态结构会减小外界环境对它的影响。荧光物质在载体微球上可以处于任何地方，也就是说，荧光物质可以位于微球的表面，也可位于微球的里面。此外，根据荧光微球的载体微球材料的不同和荧光物质的不同，我们又能对荧光微球的种类加以区分，载体微球可以为有机聚合物材料也可以为无机聚合物材料，因此我们可以将其总结归纳为三种类型即：无机有机型、无机无机型、有机有机型。

丹磺酰氯被大家所熟悉是其可作为荧光标记物运用于各个领域，丹磺酰氯是一种被运用最多最常见的荧光标记物，常被用于蛋白质和氨基酸的标记。随着医学以及生物学的发展，丹磺酰氯因其独特的化学性质和作用顺理成章的成为了医学界和生物学界研究人员的最受欢迎的荧光标记物。不仅在医学上可以用于荧光微球的制备，而且在生物工程方面也能用于荧光单体的合成。

荧光纳米粒子是指可以发荧光的半导体纳米微晶体（量子点）或将荧光团(Fluorophore)通过包埋、共价键连接以及超分子组装等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能。荧光纳米粒子是一种比传统的荧光染料效果更佳的荧光标记物，相比于传统荧光染料荧光纳米粒子，荧光纳米粒子可以说是传统荧光染料的加强版，不管是亮度还是光稳定性或者别的性质上，荧光纳米粒子都显得更加优越，效果更加的好。科学技术日新月异，生物学、化学也在不断的发展，这些科学领域所需要的技术支持也越来越强，因此，技术上无法取得突破便会影响科学的进步，人们对纳米粒子要求越来越高的同时也促进了荧光纳米粒子的发展与提高，荧光纳米粒子的发展与提高还推动了如化学传感器、生物探针等方面的发展。

复合荧光二氧化硅纳米粒子的结构包括三部分，内核、硅壳以及硅壳表面的生物分子。复合荧光二氧化硅纳米粒子作为一类新型的纳米颗粒，具有明显的核壳结构，内核材料组成上多种多样。油包水的反相微乳液法是一种常见于纳米颗粒的成核过程中的方法。核壳型生物纳米颗粒的种类多样，人们对它种类的需求也不同，而要实现核壳型生物纳米颗粒的多样化就需要不同的试剂，即不同的硅烷化试剂，运用不同的硅烷化试剂可以成功制备出表面带有不同官能团的核壳型生物纳米颗粒。此外，纳米颗粒表面的生物大分子不是一成不变的，人为的操作可以对其进行改造，当表面的生物大分子发生某些变化时，纳米颗粒的功能也会出现一些改变。由于复合荧光二氧化硅纳米粒子具有很多优点，因此被广泛的应用于生物学研究领域。现阶段，在进行一些细胞层面研究时复合荧光二氧化硅纳米粒子的运用正逐渐变得越来越广泛。

近年来反相微乳液法和改进的Stober水解法一直是研究人员提到的用于复合荧光二氧化硅纳米粒子制备的主要方法。两种制备方法各有优点，一般运用较多较广泛的是改进的Stober水解法。人们通过对反应过程的研究发现，微乳颗粒在微反应器内发生一种相互碰撞的现象，这种不同粒子间的相互碰撞会使微反应器内增溶的物质进行交换和传递行为而且会伴随着几类化学反应的进行如氧化还原反应等，我们把这种微乳颗粒的互相碰撞现象称做布朗运动。胶团在相互碰撞中会发生再交换，若反应器内已生成的颗粒发生再交换势必影响着制备的效果，而胶团在相互碰撞能够有效避免已生成的颗粒发生再交换。人们或许会疑惑粒子在微反应器中形成时，粒子的体积会随着反应的进行一直变大，这种担心完全没有必要，因为粒子在微反应器中一旦形成，表面活性剂分子就会吸附在粒子表面，粒子外层包裹的表面活性剂分子可以有效限制其体积进一步的变大。改变微反应器的大小可以控制核壳纳米颗粒的尺寸。微反应器的直径一般位于0～100nm。

Stober水解法是用于硅壳荧光纳米颗粒制备的最为常见的一种方法。Stober水解法是指形成二氧化硅的方法。此种方法的运用最早出现于上世纪六十年代，最初是用于分散二氧化硅颗粒的制备，当时就有人利用这种方法成功制备了硅壳荧光纳米颗粒，这些颗粒的大小约为二十至三十纳米。此工艺流程主要分为两个步骤，首先第一步为荧光染料富集的内核的形成，具体操作是将有机荧光染料共价修饰在硅的前体上，第二步是通过TEOS的水解及缩合反应后将硅溶胶-凝胶单体加入到硅壳包被的荧光染料内核中。此外，他们采用这种方法也可用于紫外到可见区的荧光染料为内核的复合荧光二氧化硅纳米的制备。

丹磺酰氯被人们所熟知，主要还是因为用作荧光衍生试剂用于对氨基酸的检测，作为一种经典的荧光衍生试剂，它具备着诸多的优点。由于生物胺在某些方面与氨基酸特点相似，如自身都没有荧光和紫外的发色基团，因此若不经过特殊的操作和处理无法用色谱仪检测出来。氨基酸作为一种重要生物活性物质，它们具有相似的化学性质，因此，在很多领域都对氨基酸进行分离和定量分析，其意义可想而知。对氨基酸的分离的方法有很多，其中传统方法速度较慢，消耗时间较长且易造成色谱峰的扩散使分离较为困难，所以，近年来方便、快捷的柱前衍生法越来越多的被应用于氨基酸的分离。柱前衍生是液相色谱分离分析的一种常见样品预处理方法。常用的衍生试剂有很多。丹磺酰氯(Dns-Cl)是一种绝佳的液相色谱柱前衍生试剂，用于液相色谱检测时有着诸多的优点，它不仅有着高灵敏度和良好的稳定性，而且其受到的干扰几乎没有，此外用它进行操作时也十分的简单，因此丹磺酰氯在液相色谱检测中成为了研究人员选择最多的一种衍生试剂。衍生反应的影响因素众多，所选择的衍生剂自身的物理性质以及外界环境等因素都对衍生反应产生影响，因此对衍生反应的研究也比较复杂，本文对衍生反应的最佳的衍生条件进行了简单的介绍，同时还对衍生剂和衍生物的稳定性及衍生剂的灵敏度进行了简单的研究分析。

丹磺酰氯是一种相对安全的化学品，对人体的危害相比于其它化学品要小很多，其对环境的影响也比一些危险化学品小许多。对于它的储存条件要尽可能做到避光，最好置于干燥阴凉处封闭储存，避免与其它化学品混放，特别是不能与危险化学品混放。对于它的运输只需按一般化学品按国家规定的条件运输即可，运输过程中要注意轻搬轻放，避免阳光暴晒。目前国内生产丹磺酰氯的企业还比较少，使用的大部分是由国外生产，购买的成本都比较高。所以，对于丹磺酰氯及含丹磺酰的荧光单体的合成方面的研究有着很大的意义。2 实验部分

2.1丹磺酰氯的特性

丹磺酰氯又名丹酰氯，从己烷中析出的丹磺酰氯是橙黄色毛状结晶，溶于丙酮、吡啶、苯和二氧六环，不溶于水，极缓慢地被水分解。丹磺酰氯在二甲基亚砜存在不稳定，不适合用于准备试剂溶液。可在氯化钙干燥器中稳定数月。有腐蚀性。且具有强烈的荧光。

图1 丹磺酰氯的分子式

有关丹磺酰氯的分子结构数据如下表所示：

表1丹磺酰氯的分子结构数据

摩尔折射率	71.09
摩尔体积(m3/mol)	198.1
等张比容(90.2K)	531.7
表面张力(dyne/cm)	51.8
极化率	28.18

2.2 实验原料及试剂

表2 化学原料与试剂

三乙胺	化学纯	广州市中业化工有限公司
硫酸二甲酯	化学纯	江苏省化建贸易有限公司
五氯化磷	化学纯	江西吉翔医药化工有限公司
碳酸氢钠	分析纯	上海誉洁贸易有限公司
无水乙醚	分析纯	上海子钦化工有限公司
石油醚	分析纯	上海誉洁贸易有限公司
二氯甲烷	化学纯	南京科正化工有限公司
乙酸	分析纯	常州中胜伟业化工有限公司
无水硫酸镁	分析纯	南京米兆化工有限公司
无水吡啶	分析纯	东莞市乔科化工有限公司
环己烷	分析纯	南京科正化工有限公司
正己醇	分析纯	南京司凡克化工有限公司
氨基乙酸	分析纯	上海易蒙斯化工科技有限公司
Triton X-100	分析纯	上海江莱生物科技有限公司
丙酮	分析纯	上海力明工贸有限公司

2.3实验仪器及设备

表3 实验仪器及设备

三口烧瓶	北京虹湖联合化工产品有限公司
布氏漏斗	泰兴市华科实验仪器厂
吸滤瓶	上海市兴纳生物科技有限公司
玻璃棒	上海顾村电光仪器厂
短颈漏斗	上海顾村电光仪器厂
表面皿	宜兴市晶科光学有限公司
研钵	苏州奇乐电子科技有限公司
锥形瓶	北京赛多利斯天平有限公司
970MC型荧光分光光度计	上海三科仪器有限公司
循环水真空泵、抽气管、及其他有机合成玻璃仪器

2.4 丹磺酰氯的合成

2.4.1 第一步N,N-二甲氨基-5-萘磺酸的合成

第一步反应为1-氨基-5萘磺酸的二甲基化，以1-氨基-5萘磺酸和NaHCO3为原料，缓慢滴加甲基化试剂硫酸二甲酯，在温度5～6℃下反应5小时；然后升高温度至60～70℃并保持30min。冷至室温后，浓盐酸pH值调节到1后，经过滤得固体，用盐酸重结晶两次，得白色片状晶体N,N-二甲氨基-5-萘磺酸。

2.4.2 第二步合成丹磺酰氯

取一研钵并加入少量水，分别放入制得的N,N-二甲氨基-5-萘磺酸和五氯化磷，研磨两至三小时后将糊状物倒入冰水混合物中，待有淡黄色固体产生，过滤，在真空下干燥24h。用无水乙醚萃取干燥后的固体，将萃取液蒸干，得到粗产品，用石油醚重结晶两次，得到丹磺酰氯橙黄色晶体。

图2 丹磺酰氯合成路线

2.5 丹磺酰氯烯丙基胺的合成

取一烧杯，在烧杯中加入丙酮，取适量丹磺酰氯和烯丙基胺加入其中待其溶解后加入三乙胺，控制温度在0℃，搅拌反应6h后将溶剂蒸干，将蒸干后的固体溶于二氯甲烷中，用NaHCO3溶液与乙酸溶液反复洗涤，这里采用的浓度都为3%，洗涤完成后再用无水硫酸镁干燥，一段时间后将其蒸干以石油醚重结晶得到针状淡绿色透明的丹磺酰氯烯丙基胺晶体。

图3 丹磺酰氯烯丙基胺合成路线

2.6 丹酰氯SiO2纳米发光标记物的制备

2.6.1 荧光单体硅酯前驱物的制备

取0.14g的丹磺酰氯溶于2mL丙酮，放于冰水中待其冷却，在溶液中依次加入100μL的无水吡啶，催化量的二甲基甲酰胺和117.5μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，混合物在常温下搅拌24h，所得单体未作进一步分离，得到荧光单体硅酯前驱物。

2.6.2 荧光纳米颗粒的制备

纳米颗粒的制备采用油包水的反相微乳液法,将Triton X-100 10.6mL，环己烷25mL，正己醇10.8mL，水2.25mL依次加入带塞的锥形瓶中后搅拌约15min后，再将1.20mL四乙氧基硅烷逐滴加入其中，再次搅拌，充分搅拌15min后，缓慢加入一定量的单体硅酯前驱物，为加快其水解速度，最后再加入1.20mL的氢氧化铵，常温电磁搅拌24h。待反应完全，加入丙酮，产物沉淀后离心分离，最后用水和乙醇反复洗涤，保持温度在30℃，真空干燥。

2.6.3 染料泄漏实验

取一试管，加入4mL水，取适量纳米颗粒加入试管，采用超声振荡，一段时间后试管中会形成悬浮液，用荧光分光光度计检测悬浮液的荧光强度，记录数据，然后再将悬物液离心分离，分离出的纳米颗粒再重新分散在加入4mL水的试管中，反复进行此步骤，记录数据，通过记录的数据比较荧光强度的变化确定染料泄漏的程度。

2.6.4 pH值对样品荧光性质的影响

取一烧杯加入适量的水，称取一些丹酰氯纳米颗粒加入烧杯，待其溶解后对其进行超声振荡，取多支试管，将经处理后的液体平均分配于各支试管，每支试管加到三分之一处，溶液酸碱度的调节可以通过酸和碱的滴加得以控制，滴加完成后即可测量各支试管中样品的荧光性质。

3 结果与讨论

3.1 1-氨基-5萘磺酸的二甲基化

选择硫酸二甲酯作为甲基化试剂，影响其反应的因素主要是对反应温度的控制，反应温度过高或过低都会影响反应的进程，若温度过低，反应很难进行；如果温度过高，反应会产生很多副产物，这会使收率降低且不利于纯化。反复试验后得出当反应温度在5～6℃，用0.1mol/L盐酸重结晶，可使精品收率达到最大。

3.2 N,N-二甲氨基-5-萘磺酸磺酰化合成丹磺酰氯

丹磺酰氯的合成一般有两种方法：①以二氯亚砜作酰化剂，并以二甲胺基甲酰胺(DMF)作溶剂；②以五氯化磷作酰化剂，在无溶剂存在下进行固相反应。以二氯亚砜作酰化剂时，得到的丹磺酰氯产品收率偏低，无法达到文献收率。原因主要是二氯亚砜作酰化剂需要溶剂，N,N-二甲氨基-5-萘磺酸在没有溶剂的条件下无法溶解；加入DMF作溶剂后，反应过程会产生大量的氯化氢，而产生的氯化氢会因极易与DMF结合而难以挥发而保留在溶液中。因此，反应生成的是丹磺酰氯盐酸盐，需用碱性的碳酸钠中和，过程中致使生成的丹磺酰氯一部分重新水解成了原料从而降低了收率。

用五氯化磷作酰化剂，若不加任何溶剂进行反应，收率也很不理想。原因是固相-固相间完全反应比较困难。固相和固相的反应若不经特殊处理反应速度极其缓慢，如果能够使固相和固相尽可能快的形成糊状物，便能很好的提高反应的速率，为了解决这一问题，选择潮湿的五氯化磷作为溶剂进行固相反应。

3.3 丹磺酰氯与烯丙基胺的酰胺化反应

反应中所涉及的试剂主要有三乙胺作和丙酮，烯丙基胺的化学性质非常活泼，在较低的室温下就能反应。生成的产物经过一系列的聚合反应的处理操作可以制备荧光标记的高分子微球。

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