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摘 要

选取一株实验室保藏的具有产内切葡聚糖酶（endoglucanase）活力的重组巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株作为研究对象，对其发酵条件进行研究。培养基以pH为6.0的磷酸缓冲液作为溶剂，通过改变培养基中氮源及碳源，扩大培养及发酵生产得到内切葡聚糖酶，获得的发酵液经过离心取上清液，对其用CMCA-DNS法测量540nn处吸光度，结果表明重组巴斯德毕赤酵母产内切葡聚糖酶最适宜温度为25℃；连续培养到第三天时酶活力达到最高；最优氮源为硫酸铵，最碳糖原为蔗糖。

关键词：巴斯德毕赤酵母，内切葡聚糖酶，优化

Abstract: Strain Pichia pastoris which is capable of producing endoglucanase was stored in the laboratory. Conducted research through its fermentation conditions,using fermentation conditions of production of endoglucanase.The phosphate buffer as a solvent and has a pH of 6.0. By changing the medium nitrogen source and carbon source, using the optimal expand training and fermentation conditions of production of endoglucanase, the fermentation broth obtained after centrifugation, and its absorbance at 500nn was measured by CMCA-DNS method, the results showed that: the optimum enzyme producing endoglucanase temperature is 25℃;continuous culture enzyme highest vigor when the third day;suitable nitrogen source is ammonium sulfate; the optimum carbon source is sucrose.

Key words: Pichia pastoris，endoglucanase，optimization

目 录

1 前言 7

1.1 毕赤酵母表达系统特点及应用前景 7

1.2 重组巴斯德毕赤酵母 7

1.3 内切葡聚糖酶简介 8

2 材料和方法 8

2.1 菌株 8

2.2 培养基 8

2.3 主要试剂 9

2.4 主要仪器 9

2.5 内切葡聚糖酶的制备 10

2.5.1 产酶条件比较 10

2.5.2 发酵液制备及上清液提取 11

2.6 酶活力测定 11

2.6.1 酶活力测定原理 11

2.6.2 酶活力测定过程 12

2.6.3 酶活力计算 12

3 结果与分析 14

3.1 产酶条件研究 14

3.1.1 培养时间的选择 14

3.1.2 培养成分碳源选择 14

3.1.3 氮源选择 15

3.1.4 温度选择 16

3.1.5 碳源含量选择 16

3.1.6 氮源含量选择 17

4 实验问题总结与改进方式 17

结 论 18

参考文献 19

致 谢 21

1 前言

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为外源基因表达的优良生物反应器，近年来得到分子生物学及其他领域的广泛的关注和应用^[1]。毕赤酵母作为一种甲基营养型酵母^[2]，K可以利用甲醇作为唯一碳源进行代谢，特别是在在缺乏如葡萄糖和甘油等一类抑制性碳源时，这一特点得到展现。

1.1 毕赤酵母表达系统特点及应用前景

毕赤酵母的表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一^[3]。其表达系统与大肠杆菌表达系统相比较时可发现如下几个特点：（1）能够快速繁殖，适合进行高密度培养；（2）内因含强力的醇氧化酶（alochol oxidase,AOX1）基因启动子，具有严格的调控外源蛋白表达的能力；（3）能够表达出具有天然生物活性的蛋白：巴德斯毕赤酵母的真核表达系统可以对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰；（4）可以表达复杂的蛋白质，利于后续工艺的特点有：表达的蛋白背景蛋白少、产量高、易提纯；（5）产业化生产培养条件容易达成，造价较低等，以及有其他酵母菌株表达系统无法比拟的优越之处^{[4, 5]}。与此同时，毕赤酵母表达体统也存在着一些问题，比如对于某些蛋白的分泌无法达到理想效果，其糖基化途径和哺乳动物不同，因此糖基化程度大，不同程度上影响了表达蛋白的结构和功能^[6]。

巴斯德毕赤酵母表达系统在细胞、分子生物学的理论和应用领域日益广泛。20世纪80年代初至今，巴斯德毕赤酵母的表达系统已经成功表达出500多种外源蛋白^{[7, 8]}，除了表达人畜药用制品以外，还包括多种来自动植物以及细菌的酶、蛋白和能够在晶体结构研究中发挥作用的蛋白质^[9]。对同一酶系也可以进行同时表达，要求是酶组分比例适当的全细胞作为催化^[10]。

越来越多的使用巴斯德毕赤酵母的表达系统，能够帮助人们在更好的发现、分析和解决分子生物学中遇到的许多问题的同时，更加完善巴斯德毕赤酵母的表达系统，使其在将来的理论与研究应用中发挥更加重要的作用。

1.2 重组巴斯德毕赤酵母

本次实验所用巴斯德毕赤酵母为实验室保存导入内切葡聚糖基因egl2并已优化表达的重组巴斯德毕赤酵母。影响外源基在巴斯德毕赤酵母中表达的因素有以下几点：（1）外源基因的内在特性；（2）载体和宿主菌；（3）基因拷贝数；（4）培养条件^[2]。

1.3 内切葡聚糖酶简介

纤维素酶（β-1，4-葡聚糖水解酶）是将纤维素降解成葡萄糖的一组酶的总称，它是一种复合酶，是起协同作用的多组分酶系，纤维素酶系广泛存在于多种微生物中，一种是纤维二糖水解酶，另一种是β-葡萄糖苷酶，第三种是纤维素酶系中最主要的、应用最为广泛的成分：内切葡聚糖酶^[9]。

内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanohydrolase）作为纤维素酶系中的主要成分，是一类包含多种同工酶（内切葡聚糖酶是纤维素酶系中多型性表现最为明显的^[12]），可以将可溶性纤维素水解成如葡萄糖一类的还原性寡糖的酶^[11]，。内切葡聚糖酶根据酶的来源和类型的不同，其分子量、分子结构及酶学特性会因此有所区别^[13]。

2 材料和方法

2.1 菌株

重组巴斯德毕赤酵母：导入内切葡聚糖基因egl2的巴斯德毕赤酵母，经诱导表达、菌株PE的酶表达检测，优化后分管保存于医用低温箱中。有许多方法可以增加外援基因表达量，最常用的策略之一是通过增加外源基因的拷贝数。通过查阅文献，可以发现增加重组植酸酶的拷贝书，就可使其的表达量提高1倍。从开始诱导计时，24h后，重组植酸酶就已经开始分泌内切葡聚糖酶；目标蛋白的表达量在发酵 96 h 后逐渐平稳，没有明显变化。

2.2 培养基

（1）0.1M磷酸缓冲液（pH6.0）配制：

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