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摘 要

本实验中，我们采用一种常压室温等离子体（ARTP）突变系统对解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）进行诱变，获得赤藓醇产量最高的突变株M53。M53以100 g/L葡萄糖为底物，能够生成64.8 g/L赤藓醇，比野生菌株高69.2%，而副产物产量则远低于野生菌株。为了进一步提高赤藓醇产量同时抑制副产物的生成，我们对M53发酵培养基及发酵条件进行了优化。结果发现，葡萄糖和酵母提取物分别是最佳的发酵碳源及氮源。最终优化培养基为葡萄糖200 g/L，酵母提取物0.1 g/L，Cu² 4 g/L，Mn² 15 g/L，NaCl 40 g/L，在28℃、pH 3.0、200 rpm的发酵条件下，M53的赤藓醇产量为123.7 g/L。在5-L发酵罐中进行分批补料培养，经过168 h的发酵，赤藓醇产量达到154.6 g/L，且副产品产量较低。该结果表明M53具有用于赤藓醇商业生产的潜力。

关键词：赤藓醇，常压室温等离子体诱变，解脂耶氏酵母，发酵优化，分批补料发酵

Abstract: In this experiment, we a new room temperature and atmospheric pressure plasma (ARTP) mutation system of high erythritol y.lipolytica (Yarrowia lipolytica) solution was mutated, the mutants. In these mutants, M53 erythritol yield was the highest, we choose the strain for further study. In batch culture, with 100 g/L glucose as substrate, M53 can produce 64.8 g/L erythritol, 69.2% higher than the wild type strain. At the same time, the yield was also far lower than that of the wild strain. In order to further improve the erythritol production also inhibited the formation of by-products, we of culture medium and fermentation conditions were optimized. In the optimization experiment, glucose and yeast extract were the best carbon source and nitrogen source respectively. The optimization of the final medium is 200 g/L of glucose, yeast extract 0.1 g/L, 4 g/L Cu² , Mn² 15 g/L, 40 g/L NaCl and culture temperature of 28 degrees, pH 3, the culture fermentation conditions of 200 rpm, M53 generation production of erythritol was 123.7 mg/L in. Finally, we under the above conditions, in 5 L fermentor were fed batch culture, after 168 h of fermentation, erythritol yield reached 154.6 g/L, and byproduct production is low. The results show that M53 has used for commercial production of erythritol.

Keywords: Erythritol, Room temperature and atmospheric pressure plasma mutagenesis system, Yarrowia lipolytica, Fermentation optimization, Fed batch fermentation

目 录

1 前言 4

2 材料与方法 5

2.1 菌株 5

2.2 培养基 5

2.3 培养方法 9

3 结果与讨论 7

3.1 高产赤藓醇突变株的筛选 7

3.2 碳源对M53赤藓醇发酵的影响 8

3.3 氮源对M53发酵赤藓醇的影响 9

3.4 金属离子的添加对M53赤藓醇发酵的影响 10

3.5 培养基pH、温度及搅拌速度对赤藓醇合成的影响 11

3.6 NaCl浓度对赤藓醇发酵的影响 12

3.7 5-L发酵罐中M53发酵赤藓醇的扩大培养 13

结论 16

参考文献 17

致 谢 21

1 前言

赤藓醇（1,2,3,4-丁糖醇），一个四糖多元醇，在自然界分布广泛。作为一种代谢产物或贮存化合物，赤藓醇通常存在在地衣，大麻叶和蘑菇等天然产品中。在一些发酵的食物如酒，酱油及清酒也发现含有丰富的赤藓醇^[1]。赤藓醇是一种低热量的甜味剂（热量为0.3 kcal/g），甜度为蔗糖的70-80% ^[2]。据说，人体摄入的90%的赤藓醇不能被人体代谢，而是随尿液直接排出体外而不改变血糖指数。此外，赤藓醇在动物毒理学和临床研究中已被证明是安全的甜味剂^[3]。基于以上属性，赤藓醇已被广泛应用于特殊功能食品加工，是糖尿病、心血管病和肥胖病人饮食中理想的替代甜味剂^[2]。此外，赤藓醇在口腔护理中可取代木糖醇，因为其不能被引起龋齿的细菌利用^[4]。由此可见，赤藓醇在食品卫生保健中的需求日益增长，这使得其在我们的日常生活中日益重要。

赤藓醇在自然界中含量极低，因此通过从生物体提取赤藓醇的方法获得赤藓醇是不现实的，而化学法和微生物发酵法被认为是赤藓醇大规模生产的主要途径。然而，赤藓醇化学合成需在镍催化剂的存在下，双醛淀粉在高温中化学反应后获得的，该途径效率较低，很难实现其工业化^[5]。在过去的很长一段时间内，赤藓醇的商业化生产一直依赖于短梗霉属（Aureobasidium sp.）及链霉属（Pseudozyma tsukubaensis）以葡萄糖为原料发酵合成^[6]。如今，一些能够容忍高渗透压的赤藓醇发酵菌株被相继报道，如木兰假丝酵母（Candida magnoliae）^[7]，三角酵母（Trigonopsis variabilis）^[8]，丛梗孢属（Moniliella sp.）^[9]，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）^[10,11]。最近，高产赤藓醇的Y. lipolytica获得了越来越多的关注^{[10，11，12]}，与其他赤藓醇发酵工艺相比，Y. lipolytica发酵工艺具有很多的优点，如更广泛的原料范围及对人类健康无害^[13]。事实上，作为一个传统的细胞工厂，Y. lipolytica已用于多种产品的制造，如利用不同的技术手段生产蛋白质、脂肪及有机酸^[14,15,16]。在之前的研究中，Y. lipolytica可在特定的培养系统中将纯甘油或粗甘油转化为赤藓醇。目前，许多研究通过发酵条件优化或菌种突变来提高赤藓醇发酵产量及生产力^[11,17]。

在生物技术研究和生物产业中，微生物诱变育种已广泛用于有效地改变目标菌株的基因组。传统上，细胞通常暴露于物理、化学或生物诱变剂，而后进行筛选，最终获得理想表型。最近，常压室温等离子体诱变系统（ARTP），一种新型诱变育种方法，被新开发出来。该方法有许多优势，包括低射流温度，产生均匀的等离子体，快速的突变，高度多样化的突变体，成本低及操作简单安全等^[18]，因此，ARTP已成功用于微藻、真菌和细菌等40多种的微生物突变的诱变育种^[20-22]。

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