水稻OsFWL7基因应答镉胁迫的功能研究

论文总字数：15066字

摘 要

镉是一种对人和动物危害极大的有毒金属元素，对水稻等粮食作物的质量安全构成严重威胁。FW2.2是影响番茄果实重量的一个重要数量性状基因，控制着果实大小变异的30%。FW2.2-like（FWL）基因在植物基因组中广泛存在，通过负调控细胞分裂控制器官和果实的大小，并参与镉等金属离子响应。本研究基因表达模式分析表明，OsFWL7基因特异的在根中表达并受到镉胁迫的显著诱导。进一步采用CRISPR/Cas9技术构建了OsFWL7基因突变体，在T0代纯合突变体的比例达到85.7%，杂合突变达14.3%。与野生型相比突变体的粒宽显著降低。镉处理下的表型分析发现，突变体镉处理相对于对照的根长和枝条长无显著差异，但突变体镉处理下根和叶片中的镉离子含量和正常生长条件下锌离子含量显著低于对照，而在根中的铁离子含量显著增加。结果表明，OsFWL7可能参与镉和锌等金属离子的吸收。

关键词：水稻，镉，CRISPR/Cas9，基因组编辑

Abstract:Cadmium is a toxic metal element that is extremely harmful to humans and animals and poses a serious threat to the quality safety of rice and other food crops. FW2.2 is an important quantitative trait gene that affects tomato fruit weight, controlling 30% of fruit size variation. FW2.2-like (FWL) genes are widely present in plant genomes and control the sizes of organs and fruits by negatively regulating cell division and participates in metal ion responses such as cadmium. Gene expression analyses showed that the OsFWL7 gene is specifically expressed in roots and significantly induced by cadmium stress. The OsFWL7 gene mutants were generated using CRISPR/Cas9 technology. The ratios of homozygous and heterozygous mutations in the T₀ generation reached 85.7% and 14.3%, respectively. The grain width of mutants was significantly smaller compared with that of wild-type plants. Phenotypic analysis under cadmium treatment revealed no significant differences in relative root and shoot lengthesbetween mutants and wild-type plants. However, the cadmium ion content in the roots and leaves of mutants under the cadmium treatment and the zinc ion content under normal growth conditions were significantly lower than the control, while the iron ion content in the roots was significantly higher. The results show that OsFWL7 may participate in the absorption of metal ions such as cadmium and zinc.

Key words: rice, cadmium, CRISPR/Cas9, genome editing

目录

1 前言 4

2 材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.2 实验方法 6

2.2.1 水稻镉处理 6

2.2.2 OsFWL7基因敲出突变体的构建 7

2.2.2.1 基因敲除靶点设计和水稻遗传转化 7

2.2.2.2 水稻基因组DNA的提取 7

2.2.2.3 突变位点的PCR扩增及测序 7

2.2.2.4 无T-DNA插入纯合突变体的鉴定 8

2.2.3 RNA抽提及检测 8

2.2.4 反转录 8

2.2.5 荧光定量PCR检测 9

2.2.6 原子吸收光谱测定 9

3 结果与分析 10

3.1 OsFWL7基因镉处理下的表达分析 10

3.2 OsFWL7基因敲除纯合突变体的获得 10

3.3无TDNA插入基因敲除突变体的表型分析 11

3.4 OsFWL7突变体镉处理下的表型分析 13

讨论与展望 15

参考文献 19

致谢 21

1 前言

镉是自然界中一种毒性极强的重金属元素。工业“三废”和城市生活垃圾的排放量随着中国工业化和城镇化进程的加快而增加，许多农田河流尤其是城市周边的耕地受到重金属严重污染^[1]。镉污染会影响植物的生长发育，引起植物产生叶片发黄、脱落、植株矮小甚至死亡等明显受害症状，对植物的光合作用、酶系统等新陈代谢等诸多生理生化方面也有着很大影响，从而降低作物的卫生品质，引起粮食营养品质下降^[2]。通过食物链进入人体并积累残留，对人类的健康造成严重威胁，已被公认为十大危害公众健康化学物质之一。据统计，全世界每年由于人为因素向环境中释放约有30000t的镉，其中进入到土壤中占比82%~94%^[3]。我国耕地面积中约1.13×0⁶hm²受镉污染，涉及11个省市的25个地区^[4]，且污染状况逐年严重^[5]。

fruit weight 2.2是番茄中的一个主效数量性状位点，已知控制的果实重量变异，是果实大小进化的关键。图位克隆分析发现该基因为ORFX，并重新命名为FW2.2 ^[6]。对含不同FW2.2等位基因的番茄果实进行细胞学分析发现，该基因主要不是通过调节细胞大小而是通过控制细胞分裂改变细胞数目而来调节果实的生长。进一步分析表明，该基因通过控制心皮细胞数量调节番茄果实大小，依赖于表达水平和表达时间的变化而不是编码序列的变异^[6]。其中，大果实等位基因的表达时间早、持续时间短，小果实等位基因表达峰值出现晚、持续时间更长因而发生更高水平的转录^[7]。这些结果表明FW2.2的高水平表达抑制了细胞分裂，导致果实变小。因此，FW2.2是一个细胞分裂的负调控因子。然而，FW2.2调节番茄果实细胞分裂和细胞数目的分子机理尚不明确。随后，酵母双杂交研究显示在LeFW2.2和酪蛋白激酶Ⅱ的β亚基之间有直接的相互作用^[7]，调节细胞周期。因此，FW2.2可能通过参与细胞周期调控控制细胞分裂。

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