油菜次生休眠基因BnaALAAT1的组织表达模式分析

论文总字数：10989字

摘 要

次生休眠是指不休眠的种子或者解除休眠的种子在逆境胁迫条件下获得的休眠能力。油菜种子几乎不具有初生休眠能力，但具有不同程度的次生休眠能力。油菜种子的次生休眠会引发大量自生苗的发生，且这些自生苗会导致油菜品质的降低，更为严重的是，如果自生苗是转基因油菜，那么很可能会由于花粉漂移引发生物安全问题。选育次生休眠较弱品种是解决该问题的有效途径。然而，目前对于次生休眠的遗传基础和分子机制仍不清楚。前期，我们通过RNA-seq筛选到丙氨酸转移酶BnaALAAT1在休眠前后表现明显的表达差异。本研究分析了BnaALAAT1的组织表达模式，结果表明其在受精后14天种子中表达水平最高，为进一步研究其次生休眠功能奠定了基础。

关 键 词：油菜，次生休眠，BnaALAAT1，组织表达

Abstract: Secondary dormancy is defined as the inability of a viable seed to germinate under adverse conditions. The rape seed has little or no primary dormancy but exhibits different degrees of secondary dormancy. Secondary dormancy of rape seeds can lead to a large number of volunteers which would reduce the quality of rape seeds. Moreover, the genetically modified volunteers will cause bio-safety problems due to cross-pollination. It is an effective way to solve this problem to breed the cultivars with low secondary dormancy. However, the genetic basis and molecular mechanism of secondary dormancy are still unknown. In the previous study, we identified the significant change in the expression of alanine transferase BnaALAAT1 by RNA-seq. This study analyzed the expression pattern of BnaALAAT1 and the results showed that the expression level of BnaALAAT1 was the highest in 14 day-old seeds after fertilization, laying a foundation for further research on secondary dormancy.

Keywords: rapeseed, secondary dormancy, BnaALAAT1, tissue expression

1 前言

油菜，属十字花科，也是我国重要的食用油料作物。根据油菜的性状和植物遗传亲缘关系以及植物分类特征，油菜可分为三大类型：白菜型、甘蓝型和荠菜型^[1]。甘蓝型油菜是我国主要栽培的品种，但是荠菜型和白菜型具有早熟性和很强的适应性仍在一些地区进行种植。甘蓝型油菜为雌雄同株同花作物，但是存在较大比例（约22%）^[2]的异交现象。油菜种子之所以能在田间留存主要是因为种子的休眠性。种子休眠是油菜在长期适应与进化过程中形成的，可以分为两大类型：初生休眠和次生休眠。虽然目前油菜种子的品质改良仍然是育种的主要目标，但是次生休眠所引发的一系列问题正引起广泛关注。以下将对种子休眠的定义、机制和发育过程、次生休眠机制的研究进展以及ALAAT1基因进行系统介绍和论述。

1.1 休眠的简介

1.1.1 休眠的定义

种子休眠是指具有正常活力的完整种子在温度、水分、氧气等适宜的坏境条件下不能够正常发芽的现象^[3]。种子休眠为植物提供了一种延迟发芽或延缓发育的机制，为新一代发育提供了最佳生存环境，可以定义种子能够萌发的最佳时间和空间。种子休眠能够减少同类物种之间个体的竞争，以及保证种子能够在适宜的季节发芽。但是对于物种的栽培来说，种植者为了获得大量的经济效益，在生产过程中就不得不保证种子能够快速的发芽和成苗。但是种子由于缺乏休眠一般会在高温、多雨的坏境下萌发，特别是在成熟期的时候，这就导致种子萌发成为生产过程中不可忽视的问题。

最近几年来，对于休眠的定义是很困难的，因为休眠只能通过不发芽来衡量，往往用萌发率来表示。在某一特定条件下种子批的萌发率与萌发速率是不一样的，但对于单个种子而言，种子萌发过程是一种全或者无的事件。Fenner和Thompson^[4]认为休眠与萌发是相互联系的，参与萌发的坏境因子在发生改变的同时也会影响种子的休眠。

1.1.2 种子休眠的机理

种子休眠有两种情况^[5]：（1）缺乏激素或萌发的物质，导致胚发育未完成和生理上的不成熟。对于此类情况，可通过变温处理、添加激素、干燥、光照处理等方法进行处理。（2）种壳存在抑制萌发的物质或者种壳不透气、不透水等原因，造成种子休眠，对于此类情况，可通过去除种壳、破坏种皮、药剂处理、机械处理、冲洗处理等物理和化学方法解除休眠。总而言之，找出种子休眠的原因是一个复杂的过程，而它们原因的类型是综合性的，也就是综合休眠^[6]。

生物学家对于种子休眠机制的探究已经进行了很长的时间，而且对于其理解也慢慢的分成了两个学派。首先，法国学派认为激素并不是休眠的关键，休眠是由内外多种因素控制的复杂的过程，这些内外因的作用下自发的调节休眠过程。对于古典学派而言，他们认为休眠从开始到结束一直受到生长抑制剂和促进剂的影响，这两种生长剂对种子休眠起着平衡调节的作用；种子从原来的休眠状态到活化状态，再从活化状态到休眠状态这个过程在很大程度上是由于坏境因子导致的，坏境因子会在激素的作用下改变休眠阶段。

休眠状态不仅受到种子成熟环境的影响，而且随着时间的推移也会随着周围环境的变化而不断变化。高等植物在所有主要气候地区的都存在休眠，而且高等植物因环境会产生不同反应。对此，许多学者提出了种子休眠机制的进化、分子遗传学、生理学、生物化学和生态学以及它们对萌发的控制的综合观点。

1.1.3 植物激素对种子休眠的调节

ABA是影响种子萌发与休眠诱导的重要因子，这种因子既起着正调节作用也起着负调节作用^[7]。首先，种子休眠状态的引诱和保持离不开内源ABA。研究表明，如果ABA的含量过多的话，就会加速种子的休眠或者抑制种子的萌发。如果ABA的含量过少的话，成熟的种子就会缺乏初生休眠。这两种反应可以分别通过抗ABA抗体的转基因烟草和拟南芥突变体cyp707a2的研究中得到证明，比如转基因烟草缺少APA，则烟草的APA合成基因会由于过度表达导致种子休眠^[8]；拟南芥突变体cyp707a2APA含量增加，则其ABA分解代谢酶因受到抑制而发生休眠现象^[9]。

种子休眠是一个可遗传性状，可由植物激素脱落酸和赤霉素促进产生，对环境具有重要影响。Finch-Savage和Leubner-Metzger^[10]提出了GA和ABA参与坏境因子调控种子萌发与休眠的模型。根据这个模型图，ABA:GA的平衡会受到周围的坏境的变化而受到干扰。ABA和GA共同作用决定着种子的转变过程。在三种（坏境敏感性、激素的降解和激素的合成）的相互作用下，种子开始出现休眠上的循坏。

图1 脱落酸和赤霉素调控种子休眠与萌发

1.1.4 休眠的分类

种子休眠是为了适应坏境而产生的形状，但在其适应的过程可分为初生休眠和此生休眠。初生休眠与次生休眠（primary dormancy）是种子成熟后就具有并在母体上形成的休眠^[11]。次生休眠或二次休眠（secondary dormancy）是指由于在不适宜的坏境如缺少光照、高温或者高二氧化碳等的影响下，种子从原来的无休眠状态到被诱发的休眠状态^[12]。

初生休眠和次生休眠除了有各自的含义和机理，他们之间也会发生休眠循坏。初生休眠种子会因外部坏境条件发生变化而发生生理状态的变化，直至休眠的解除，如果这时候的外界坏境不能满足种子萌发的条件，就会发生次生休眠，逆向导致生理状态的一系列的变化，种子再次进入休眠状态。当次生休眠再次启动，将种子再次放置在适宜的条件下，种子也不能够萌发。这种休眠上的循坏能够有效的避开外界不适宜的坏境条件，这也是植物在适应不良条件下长期适应的结果。

种子休眠也会随着研究的深入与积累发生休眠类型的划分，如光休眠、暗休眠、深休眠、浅休眠、初生休眠、次生休眠、条件休眠等。本文重点研究油菜种子的次生休眠，旨在为生产工作者和种植人员提供一些的参考与信息。

图2 种子休眠

1.2 油菜种子次生休眠的危害

1.2.1 对生产的影响

一方面，它的次生休眠会对油菜生产区造成持续危害。油菜在收获的时候会出现很多脱落的油菜籽，这些油菜籽能够在油菜产区生存数年，继而导致自生苗不间断繁衍，成为油菜基因扩散的重要载体^[13]。除此之外，耕作方式的不同与油菜籽自身具有的落粒特性也会导致大量自生苗的诞生。另一方面，随着自生苗的基因扩散，低芥酸和低硫甙这两个“双低”性状在油菜生产中极容易丢失。大量自生苗的存在不仅会造成非生产区杂草竞争、增加工作量，而且也会污染种子的纯度，甚至会降低种子的品质。总之，次生休眠一旦被诱导，可能会给种植油菜的人带来损失比如杂草的竞争性、种植物品质下降等，对生产者和工作者造成很大的损失。但次生休眠种子具有高油，富含RNA酶，活性低等特点^[14]，致使其RNA的提取一直是大家急需解决的难题。

为了防止或减少自生油菜发生和防止产区作物生物学的混乱，就要研究不同种子次生休眠发生的油菜基因型的变化并通过育种的方式来解决。不少生物学家已经研究角果抗裂性好的油菜品种，但短时间很难培育出良好的品种应用于实际生产中^[15]。

1.2.2 对坏境和食品安全的影响

随着转基因油菜技术的广泛推广，人们发现在油菜田中发现多种抗不同种类除草剂的自生苗，这对转基因油菜坏境安全性产生极大的质疑。由于异花授粉或种子与其他作物的混合，会导致新种植的油菜作物种子质量下降，比如混合了欧洲油菜类型会导致收获作物的污染问题用于消费或工业用途。转基因本来就存在很大的风险，而自生苗的诞生将加剧此类基因的扩散，对未来坏境安全造成潜在的风险。尽管使用低种子休眠能力的品种可以帮助减少土壤种子库中菜籽的数量和了解控制油菜强烈诱导次生种子休眠的因素和监管机构，但自生苗引发的基因扩散风险，已经成为油菜生产和转基因油菜坏境安全管理中十分棘手的问题^[16]。

1.3 次生休眠的研究进展

人们发现，尽管初生休眠对于油菜种子而言很少出现，但是如果在缺少适宜生存的条件下如缺氧、低温、缺水等逆境胁迫，种子因不能正常发芽会诱发次生休眠。现如今，人们虽然对油菜次生休眠的生态机制处于探索阶段，但是已经发现能够测定油菜次生休眠特性的方法。目前测定油菜次生休眠特性的方法有2种：实验室诱导法和田间埋藏处理法。第一种是由Pekrun和 Lutman^[17]建立的实验室诱导法，先用PEG处理和诱导种子，然后根据种子萌发的情况来定义休眠性。第二种是田间埋藏处理法，根据种子自然掉落的生长情况，先将种子埋入土中,然后计算不发芽的活种子个数。

随着对次生休眠的进一步研究，研究学者已经发现了有效诱发该特性的条件，比如渗透胁迫处理。除此之外，遗传因素影响品种诱导差异的研究结论,也为研究次生休眠提供了方向。虽然有很多证据显示，种子维持休眠状态与种子基因转录活性变化密切关联^[18]。但是想要获得种子次生休眠诱导原因，就必须识别那些表达差异的基因。我们相信随着转录组测序技术（RNA-seq）的成熟，人们将会进一步打开次生休眠的神秘面纱。

1.4 大麦休眠基因 ALAAT1的研究进展

经过研究，人们发现种子休眠的机制能够使野生大麦在炎热干燥的夏季得以存活。在野生大麦由自然繁殖变为人工控制下的过程中，生物学家发现所培育大麦的休眠时间较短。生物学家从野生大麦中分离出种子休眠基因Qsd1，其编码了丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)。种子休眠基因在胚中特异表达，而由长变短的休眠等位基因编码的ALAAT等酶在单个氨基酸残基中存在差异。减少的休眠等位基因Qsd1是由最初在黎曼南部被人工种植的大麦进化而来的，所以它的长休眠Qsd1等位基因可以追溯到野生的大麦。在啤酒和威士忌生产等工业应用中，啤酒和威士忌产量的提高，可能导致了大麦的休眠突变。与此相反，较长休眠等位基因可能被用于控制较高降雨量地区的发芽和收获，以增强全球对大麦的适应能力^[19]。

图3 核苷酸和Qsd1在休眠野生大麦H602中的氨基酸序列

在大麦谷物的休眠中，AlaAT是至关重要的。从实际的角度来看，研究结果表明了长休眠的Qsd1基因似乎是一个可变的基因，这种基因可以用于适应不同的环境，这与自然界中存在的Qsd1序列的变化是一致的。例如，长休眠Qsd1基因可用于控制较高降水区域的收获发芽，以增强全球对大麦的适应性^[20]。另一方面，携带Qsd1突变的突变体与已开发的用于工业用途的大麦生产线相关联，如麦芽和酿酒工业。在大麦人工种植后，人们发现的Qsd1突变是人类利用大麦从食物转化为饮料所必不可少的证据，并进一步表明关于古代农业社会发展在很大程度上受人类食用驱动的争论。

1.5 BnaALAAT1基因的相关研究

前期，我们对筛选好的次生休眠强弱品种进行RNA转录组测序（RNA-seq），BnaALAAT1基因在油菜次生休眠种子中其表达水平发生了明显变化^[21]。结合前期大麦中该基因的功能研究，据此，我们推测BnaALAAT1基因控制着油菜种子的次生休眠的发生。为进一步了解BnaALAAT1基因在油菜次生休眠方面的功能，我们首先对其组织表达模式进行了详细分析。

本研究以油菜为实验材料，进行油菜品种不同组织和器官的RNA提取、PCR扩增，探究BnaALAAT1基因在不同组织中的表达变化，并为实际生产中油菜的栽培提供一定的理论依据和指导，减少因次生休眠而导致油菜生产地区的危害。

2材料与方法：

2.1材料

油菜强次生休眠品种16b-Z-Z-Z。

2.2 RNA提取

参照TaKaRa公司TaKaRa RNAiso Reagent 说明书步骤，略有改动。

2.3 反转录

参照TIANGEN公司Gdna Dispelling RT SuperMix说明书步骤，稍有改进。

2.4 实时荧光定量PCR

请参阅TaKaRa SYBR Premix Ex Taq试剂及CFX real time PCR instrument (Bio-Rad)说明。

3 结果与分析

3.1 RNA提取

为分析BnaALAAT1的组织表达模式，我们对油菜营养生长阶段的根、茎、叶、小苗以及生殖生长阶段的受精后的7天种子、14天种子、21天种子和28天种子进行取材，并进行总RNA的提取。提取后的RNA进行电泳结果，如下图所示：

图4 油菜不同组织总RNA电泳图

从上图可知，提取的总RNA共有三条条带，分为28S、18S、5S，其中，28S亮度最大，5S亮度最小，且28S：18S约在2倍左右，表明RNA质量良好，可以用于下游反应。

3.2 BnaALAAT1特异引物设计

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