论文总字数：15302字

摘 要

本文就在不同N供应条件下对芽孢杆菌发酵效果的影响进行研究，设立了17.5：1、20：1、22.5：1、25：1四个不同程度的碳氮比。试验中使用的菌株为枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。在最佳发酵条件下培养24 h后，发酵液的浓度达到10⁹CFU/ml，用串联浓度梯度串联稀释后，用平板计数法测定活细胞数，以活细胞数作为指标评估介质的质量。以碳氮比为20:1获得最高活细胞计数。发酵24h后枯草芽孢杆菌M-5最大活菌数为5.63×10⁹CFU/ml，蜡质芽孢杆菌M-7为5.1×10⁹CFU/ml，巨大芽孢杆菌M-13为5.8×10⁹CFU/ml。即发酵培养基配比为9.412g玉米粉、0.588g黄豆粉时，芽孢杆菌的发酵效果最优。我们将继续探索不同N供应水平下扩大发酵的工艺研究，以期为生产提供理论依据。

关键词：芽孢杆菌，混合发酵，碳氮比

Abstract：In this paper, the effects of different N supply conditions on the fermentation effect of Bacillus were studied, and the carbon and nitrogen ratios of four different degrees of 17.5:1, 20:1, 22.5:1, and 25:1 were established. The strains used in the tests were Bacillus subtilis, Bacillus cereus, and Bacillus megaterium. After cultured for 24 h under the optimal fermentation conditions, the concentration of broth reached a level of 10⁹ CFU/ml. After serial dilution by serial concentration gradient, the number of viable cells was determined by plate count method, and the number of viable cells was used as an index to evaluate the quality of the medium. The highest viable cell count was obtained with a carbon to nitrogen ratio of 20:1. After 24 hours of fermentation, the maximum viable count of Bacillus subtilis M-5 was 5.63×10⁹ CFU/ml and that of Bacillus cereus M-7 was 5.1×10⁹ CFU. /ml, Bacillus megaterium M-13 was 5.8×10⁹CFU/ml. When the ratio of fermentation medium is 9.412g corn flour and 0.588g soybean flour, the fermentation effect of Bacillus is optimal. We will continue to explore the process of expanding fermentation at different levels of N supply in order to provide a theoretical basis for production.

Keywords：Bacillus；Mixed fermentation；Carbon to nitrogen ratio

目 录

1 前言 6

1.1 发酵培养基成分的影响 6

1.1.1 培养基中的碳源 6

1.1.2 培养基中的氮源 6

1. 2 发酵中培养条件的影响 7

1.2.1 发酵中接种量及种龄的影响 7

1.2.2 发酵中温度的影响 7

1.2.3 发酵中溶氧量的影响 8

1.3 试验菌种的选择 8

1.3.1 枯草芽孢杆菌的属性 8

1.3.2 蜡质芽孢杆菌的属性 8

1.3.3 巨大芽孢杆菌的属性 9

2 实验材料与培养方法 9

2.1 实验材料 9

2.1.1 实验菌种 9

2.1.2 培养基 9

2.2 培养方法 9

2.2.1 发酵条件的确定 9

2.2.2 种子培养 10

2.2.3 扩大培养 10

2.2.4 发酵培养基的优化 10

3 结果与分析 11

3.1 实验数据 11

3.2 数据分析 13

结 论 15

参 考 文 献 16

致谢 19

前言

由于考虑到符合环境保护、人类健康和食品安全三个方面的需要，开发高效生物农药以替代或部分替代当前条件下的化学杀菌剂是当前的趋势。而生物防治的基础则是获得高效的拮抗菌^[1]。芽孢杆菌属(Bacillus spp.)是土壤和植物微生态的优势种群, 作为植物根际有益微生物, 通过分泌抗生物质和生长竞争在防治植物病害方面发挥多种有益作用^[2]。当应用于防治病害时，需要使芽孢杆菌的生物制剂所发挥的抑菌作用处于长时间有效状态，并优化活微生物制剂的加工，在一定程度上延长保质期，使其得以使用。促进环境中的生存。存在耐热、抗应力孢子的定植和繁殖。这也在一定程度上为活菌制剂的加工和延长保质期提供了良好的条件^[3-4]。在实验室中培养细菌时所采用的培养基配制成本高昂，运用到大规模生产中则需要选择一些成本较低的培养基，并尽可能地提高产菌效率。芽孢杆菌的发酵培养基配方的主要成分有玉米粉、葡萄糖、黄豆粉、鱼粉以及其他的一些矿质元素、微量元素等。由于成分的选择和配比的不当通常会使得发酵液的含菌量不高，因此发酵培养基的成分以及配比对芽孢杆菌发酵后的产量会有较大的影响^[5]。培养基的不同成分，如氮源、碳源、微量元素等的选择是目前国内外对发酵工艺的主要研究方向，另外还有发酵条件包括发酵时的转速、pH值、温度等方面的优化。通过对工艺方法在不同方面的优化，使发酵过程的生产效率更高，并使其生产成本更低，来促进发酵工程技术的快速发展^[6]。

1.1 发酵中培养基成分的影响

发酵培养基为微生物代谢产物的合成和大量生产提供了必需的营养素和能量需求^[7]。细菌的繁殖能力、产品的生物合成效率，甚至产品的产量和质量与其组成和比例密切相关^[8-9]。微生物菌种的研究领域和工业生产中所用的培养基也不同，这是由于菌株的选择和生长以及发酵条件的不同所致。

1.1.1 培养基中的碳源

碳源在发酵培养基中既可以起到为提供微生物能量使其正常生长发育，也能作为碳来源成为微生物的必要成分和一些代谢产物。碳化合物在微生物中起着不可或缺的作用，己糖是大多数微生物的重要碳源和能源。在多种条件因素的影响下尤其是成本和材料易得性，当今发酵工程研究中主要用到的是淀粉（玉米粉、山芋粉、大米等）、蔗糖、纤维素等^[10]。

1.1.2 培养基中的氮源

氮源在培养基中的主要作用是作为微生物细胞材料和含氮代谢物的氮源。容易获得的氮源是有机或无机氮源，其可被细菌直接吸收为蛋白质降解产物。这通常有利于细菌的生长；与之相对的迟效氮源即一些必须通过水解后降解形成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用的蛋白，迟效氮源则有利于代谢产物的形成^[10]。一般的NH₄NO₃、尿素，(NH₄)₂SO₄、牛肉提取物和一些高蛋白含量的黄豆粉等，用于实验室和工业生产中的氮源的制造^[11-13]。一些学者将氮源和长效氮源组合在发酵培养基中，制备出一种复合氮源，该复合氮源是用(NH₄)₂SO₄、蛋白胨和酵母提取物配制的，以满足产品合成和氮细菌发酵的需要。

1. 2 发酵中培养条件的影响

1.2.1 发酵中接种量及种龄的影响

接入种子液中的目标微生物的生长期是种龄，微生物细胞在中对数生长阶段最为活跃，此时所选种的种子液最适合接种。为了使目标微生物迅速进入对数生长阶段并缩短发酵周期，从而提高产品质量，不仅需要合适的种子液体，而且需要适当的接种量来进入发酵培养基。如果苗龄太短或太长，它将导致发酵周期的延长，这将降低细菌的活力，甚至导致细菌的过早老化和自溶^[14]。如果接种量过大，培养基消耗加快，细菌迅速进入稳定和衰亡阶段，对发酵产物的发酵过程有很大影响；如果接种量太小，则细胞生长数量少。细菌细胞生长量很小，则会导致对数生长延迟，发酵时间会延长，也会对一些酶产品的生产产生不利影响。

1.2.2 发酵中温度的影响

主要是在直接和间接的影响两个侧面产生的温度的影响。我们把产生直接影响的一些微生物的增殖率、酶活性、以及细胞的营养要求的称为直接效应，有相对应一些影响溶质分子的溶解性和细胞膜渗透压的表面张力效果的，我们被称为间接效应。温度过高会导致微生物细胞内的酶活性遭到破坏，同时微生物细胞中的蛋白质也会因过热产生变性和凝固，致使微生物的死亡，温度过低则会抑制微生物的生长。同时研究表明，通常用于防治植物病害的普城沙雷氏菌在一定温度范围内，温度的升高会加快它的生长速率，也会增大最大菌液浓度，但会抑制沙雷氏菌的生长，在进行发酵条件优化后可得沙雷氏菌的最适发酵温度是28℃^[15]。还有一些微生物在培养时每个发酵阶段的最适温度也不同。如在青霉素的发酵过程中， 如果按照最初5 h 30℃、6~35 h 25℃、36~85 h 20℃， 最后40 h 再升到25℃的方式来控制各阶段的发酵温度， 可使发酵后青霉素产量比25℃恒温培养提高10.7%^[16]。

1.2.3 发酵中溶氧量的影响

发酵过程中的另一个重要因素是溶解量。一些需氧微生物需要在发酵过程中通过大量的空气进入液体中以满足它们的溶解氧需求。溶解氧影响次生代谢产物的合成，并改变代谢时的合成速率^[17]。在发酵过程中，菌体的密度很高，导致在发酵过程中需要消耗大量的氧气。因此，通常采用用于减小液体体积和提高转速的摇瓶条件。一般来说，增加搅拌速度和增加空气流量来达到增加溶氧量的目的^[18]。研究发现枯草芽孢杆菌B47产生的抗菌物质最具影响的因素是液体负荷^[19]，液体负荷越小，抗菌物质的产量越大。同时，研究表明当氧气量过大时，菌体自动溶解现象出现，导致孢子减少^[20]。

1.3 试验菌种的选择

芽孢杆菌（4-10um）是需氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌。这种属细菌的一个重要特征是产生特别抵抗不利条件的孢子的能力。大多数是无夹膜的，并且具有行动能力，通常是过氧化氢酶阳性。包括蜡状芽孢杆菌，可引起食物中毒，炭疽芽孢杆菌会使人和动物患病，非致病性枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、镰刀菌等。

1.3.1 枯草芽孢杆菌的属性

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）属芽孢杆菌属。枯草菌是安全且有益的微生物。没有对环境的污染，也不会给人和动物造成危害。枯草芽孢杆菌可以在其增殖和代谢之间产生抗菌物质。这些抗菌性物质可以阻碍细菌、霉菌、病毒和酵母。生物学的控制有重要的适用价值^[21-22]。细菌的抗菌物质具有广泛的抗菌效果。通过优化发酵条件和发酵培养，提供最高的生长环境，改善抗菌和抗菌物质的收量^[23-25]。

1.3.2 蜡质芽孢杆菌的属性

蜡质芽孢杆菌（B.cerues），其产生的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶具有很强的生物活性，且能产生热稳定性很高的抗菌活性蛋白，在自然界中广泛存在，对环境没有污染作用，反而具有抑制动植物病害的作用^[26]。且具有芽孢杆菌易保存的通性，因此广泛应用于食品、农业和医疗保健等领域^[27]。王世荣研制的“健康生”是用蜡质芽孢杆菌DM423配合乳酸菌合成的。蜡质芽孢杆菌DLSL-2的微生物制剂可在水中产生大量的胞外酶以用于分解动物和浮游生物的尸体和排泄物以及一些残存饲料等有机物，其优点在于可以避免使用抗生素作为药品和食品添加剂所带来的副作用^[28]。正交设计和均匀设计作为两种主要的微生物培育实验方法，各有优缺点，正交设计可用少量的实验得出结果，而均匀实验则更为经济和节省劳动。

1.3.3 巨大芽孢杆菌的属性

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）是一种以植物根系为基础的促生细菌^[29]。它是一种常用的微生物肥料，是一种溶磷和促钾的细菌。土壤中的有机磷和无机磷是植物所不能直接获得的，但巨大芽孢杆菌可以将其分解。因此，土壤肥力得到提高^[30-31]，作物产量的效应也相应增加^[32-33]。与固氮菌合作可以提高固氮率^[34-35]，降低水中有机氮、磷，降低废水中氰化物，有助于维持水环境的生态平衡^[36-38]；巨大芽孢杆菌能产生亚硝酸盐还原酶^[39]，降低食物中亚硝酸盐含量。因此，巨大芽孢杆菌具有非常广阔的应用前景。

实验的材料及培养方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M-5、蜡质芽孢杆菌（B.cerues）M-7、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）M-13菌株由江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室李师默老师提供。

2.1.2 培养基

PDA 培养基（1L）：土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g。

根据培养基配方，将200g去皮马铃薯称重，切成小块，放入锅中加入1000毫升水。加热0.5h后，纱布过滤取滤液。将滤液补充到1000毫升后，将其倒入锅中并加入20g葡萄糖，5g蛋白胨，用玻璃棒不断搅拌小火。溶液完全溶解后，补充至1000毫升水。

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