SUMO酶切效率影响因子的初步研究

论文总字数：16956字

摘 要

在蛋白纯化过程中，融合SUMO标签多运用于基因工程菌高效表达正确折叠的可溶性蛋白，起到抗蛋白酶降解、提高蛋白正确折叠率、提高表达量等作用。SUMO蛋白酶是切割SUMO融合蛋白获得具有天然序列靶蛋白的一种工具酶，其酶切效率高、特异性好。不同于其他蛋白酶在酶切时只识别特定氨基酸序列，SUMO蛋白酶识别的是三级结构，所以其在切割后不会残留多余氨基酸。为了探究SUMO酶最优酶切效率的条件，本研究分别从时间、温度、pH、缓冲液组分等方面对SUMO蛋白酶酶切效率的影响做了初步探究，旨在探索最适酶切条件，使得SUMO蛋白酶具有最优酶切效率。

关键词：SUMO蛋白酶；影响因子；酶切效率

Abstract: Small ubiquitin-related modifier (SUMO) is a kind of protein with high conservation and low molecular weight in species evolution. It is widely present in eukaryotic cells and can be modified, including regulating　protein transport, maintaining gene integrity, and participating in protein post-translational modification. Fusion of SUMO tags are widely used in engineering bacteria to efficiently express correctly folded soluble proteins, which can prevent protease degradation, improve the correct folding rate of protein, and increase the expression level. SUMO protease is a tool for cleavage of SUMO fusion protein to obtain a target protein with natural sequence, and has high enzymatic cleavage efficiency and specificity. In this paper, the efficiency of SUMO protease digestion was studied from the aspects of time, temperature, pH and buffer composition, in order to investigate the optimal conditions for enzyme digestion, so that SUMO protease has the optimal enzyme digestion efficiency.

Key words: SUMO protease; Influencing factor; Enzyme digestion efficiency

目 录

1. 前 言 4

1.1 研究背景 4

1.2 SUMO简介 4

1.3 SUMO融合表达系统的优点 5

1.3.1 提高融合蛋白的正确折叠率 5

1.3.2 提高融合蛋白的稳定性 5

1.3.3 提高融合蛋白的表达量 5

1.4 SUMO蛋白酶 5

1.4.1 SUMO蛋白酶简介 5

1.4.2 SUMO蛋白酶切条件 6

1.5 实验思路设计 6

2. 材料与方法 7

2.1 材料 7

2.2 SDS-PAGE的配方、制备及电泳 7

2.2.1 SDS-PAGE的配方 7

2.2.2 SDS-PAGE的制备 7

2.3 实验方法 8

2.3.1 SUMO蛋白酶酶切的底物与反应环境 8

2.3.2 SUMO蛋白酶酶切效率探究 8

2.3.3 SUMO酶切效率测定及鉴定方法 10

3. 结果与分析 12

3.1 SUMO蛋白酶酶切后SDS-PAGE图及初步分析 12

3.1.1 不同的SUMO酶与底物比例下酶切后的SDS-PAGE 12

3.1.2 不同温度酶切后的SDS-PAGE 12

3.1.3 不同酶切时间酶切后的SDS-PAGE 13

3.1.4 不同pH酶切后的SDS-PAGE 14

3.1.5 不同添加剂酶切后的SDS-PAGE 14

3.2 蛋白灰度分析SUMO蛋白酶酶切效率 17

4. 结论与展望 22

参考文献 23

致 谢 25

1. 前 言

1.1 研究背景

近年来，利用基因工程菌表达纯化融合蛋白的技术愈发成熟，大肠杆菌是常被用于表达各种融合蛋白的宿主菌。利用大肠杆菌大量表达融合蛋白时，常因蛋白中含有二硫键从而导致蛋白不能正确折叠而形成错误结构的不溶性包涵体^[1]。包涵体蛋白经纯化后不具有活性，虽然可以通过复性获得有活性的可溶的蛋白质，但该过程往往会损失大量蛋白，导致纯化得率大幅降低。

因此，很多融合标签被运用到表达融合蛋白中，用来提高靶蛋白的可溶性。例如MBP（maltose-binding protein，麦芽糖结合蛋白）、GST（glutathione S-transferase，谷胱甘肽转移酶）等相对分子质量较大的标签融合表达天然蛋白可以显著提高其可溶性^{[2, 3]}，但是这几种标签需要在较低的诱导温度下才能高效表达靶蛋白，因此对大规模的工业生产会产生不利的影响。MBP、GST等分子质量较大的标签可以使得组氨酸等相对分子质量较小的融合蛋白易于纯化，但对其可溶性无明显促进作用^[4]。SUMO（Small ubiquitin-related modifier，小分子泛素相关修饰蛋白）是相对分子质量较小的标签蛋白，其相对分子质量只有11.5kDa^[5]，目前SUMO标签蛋白已成功应用于多种蛋白的可溶性表达，其中包括肝素酶Ⅰ、核衣壳蛋白、膜蛋白以及MMP13、GDF8等蛋白^{[4, 6]}。SUMO标签能够提高蛋白质的折叠效率、抗蛋白酶降解、提高重组蛋白的表达量等^[7]。将SUMO-底物蛋白偶合物水解成SUMO和底物的过程称为去SUMO化^[8]，此过程应用到SUMO蛋白酶作为切割工具。

1.2 SUMO简介

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