大肠杆菌E2株野生型和突变型基因表达差异分析

论文总字数：8655字

摘 要

本研究运用野生型禽致病性大肠杆菌（APEC）E2株及其smpB和ssrA基因缺失突变株E2ΔsmpBΔssrA，用荧光定量PCR的方法检测cpxR3，glnL1，glnL2,glnH,ompF2，rfaH这6个基因在这两株细菌中的转录表达差异。探讨ssrA与smpB构成的tmRNA系统对基因表达的影响。结果显示，tmRNA系统中的ompF2、glnL1和rfaH 的转录水平显著变化，然而，与野生株相比，cpxR3和glnL2的转录没有显著差异。

关键词：禽致病性大肠杆菌，野生株，突变株，荧光定量PCR，基因表达差异

Abstract：This study use of wild type avian pathogenic Escherichia coli (APEC) E2 strain and its smpB and ssrA gene deletion mutant strains E2 Δ smpB Δ ssrA, use the method of fluorescence quantitative PCR detection cpxR3, glnL1, glnL2, ompF2, glnH, rfaH the six genes transcription expression differences in the two strains of bacteria. To investigate the effect of tmRNA system composed of ssrA and smpB on gene expression. The results showed that the transcription levels of ompF2、glnL1 and rfaH were significantly changed. However, the transcription levels of cpxR3 and glnL2 were not significantly different from those of wild strains.

Keywords：Avian pathogenic Escherichia coli，wild strains，mutant，Fluorescence quantitative PCR，Gene expression difference

目录

1前言…………………………………………………………………………………… 4

2材料……………………………………………………………………………5

2.1菌株…………………………………………………………………………… 5

2.2主要试剂………………………………………………………………………… 5

2.3引物序列………………………………………………………………………… 5

2.4主要仪器…………………………………………………………………… 5

3实验方法……………………………………………………………………………… 5

3.1细菌的复苏培养……………………………………………………………… 5

3.2复苏细菌的鉴定……………………………………………………………… 6

3.3RNA的提取和反转录反应…………………………………………… 6

3.3.1RNA的提取…………………………………………………………… 6

3.3.2反转录反应…………………………………………………………… 7

3.4反转录产物的荧光定量PCR …………………………………… 7

3.4.1模板的制备及稀释…………………………………………………… 8

3.4.2荧光定量PCR……………………………………………………………… 8

3.4.3数据的处理……………………………………………………………… 9

4实验结果…………………………………………………………………………… 9

4.1复苏细菌的结果………………………………………………………… 9

4.2PCR实验的结果………………………………………………………… 9

4.3RNA提取的电泳……………………………………………………… 10

4.4荧光定量PCR的结果………………………………………………… 10

结论 ………………………………………………………………………………… 14

参考文献………………………………………………………………………………15

致谢………………………………………………………………………………… 16

1 前言

大肠杆菌是普通原核生物，属于革兰氏阴性细菌（G-），是人和动物肠道中的正常栖居菌^[1]。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料。在很长一段时间，它被当作是正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。随着时间的流逝和科技的发达，人们逐渐认识到人和动物体内还是存在着小部分有着特殊血清型的大肠杆菌的，常常会引起严重的腹泻和败血症。在所有大肠杆菌病中，禽大肠杆菌病对幼畜有着极大的威胁力，给世界各地的养禽业都带来了巨大的经济损耗。禽大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌引起的多种病的总称 ^[2]。此病病原属于非抗酸性、染色均一的不形成芽孢的两端钝圆的短杆菌，需氧或兼性厌氧^[3]。

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术的基础上,将荧光基因加入PCR体系,通过观察荧光基因信号的聚集位置和分布状态,从而监测整个PCR反应过程^[4]。本实验所运用的荧光定量PCR方法属于非特异性检测法，是依靠荧光染料进行的操作。非特异性检测法是指在PCR体系中加入过量的荧光染料，放入荧光定量PCR仪中，通过其发射出来的特殊光线穿过八连管盖照射到反应体系中，从而发出荧光信号。此方法的优点是操作简便，需要注意的事项有1、滴加试剂时要小心并且精确；2、八连管盖上必须保持干净，以免光线不能透过，导致实验产生误差；3、DNA模板的添加必须精确，否则会导致C_T产生较大误差。

本研究以大肠杆菌野生株E2和双突变株作为材料，进行培养、提取RNA，采用反转录和实时荧光定量PCR进行数据处理和结果分析。本实验需要观察的实时荧光定量PCR的重要参数：①荧光域值（以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍^[5]）②Ct值，也称循环阈值（Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的 PCR反应循环数^[5]。）根据实时荧光定量PCR技术得出的数据绘制曲线以及求出R²，再通过这些数据观察野生株E2和双突变株对不同引物的相对表达情况，最后通过公式的计算判断引物对野生株E2和双突变株的转录水平的差异是否显著。

2 材料

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