论文总字数：10580字

摘 要

研究人参皂苷R4对6-OHDA损伤PC12细胞的保护作用机制，用几种不同浓度的人参皂苷R4处理PC12细胞与用6-OHDA处理的细胞做对比。参考MTT法检测出的细胞活力，得出6-OHDA可以显著降低细胞活力，而人参皂苷R4处理后抑制了其变化；流式细胞结果显示，6-OHDA处理明显诱导了细胞的凋亡和损伤，而人参皂苷R4处理后降低了PC12细胞的凋亡；蛋白印迹法显示，对于6-OHDA处理的PC12细胞，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的蛋白表达水平高于正常细胞，人参皂苷R4预处理以激活依赖型方式降低了Caspase家族蛋白的表达水平；同样，Bax蛋白表达和Caspase家族蛋白水平一致。人参皂苷R4以剂量依赖性方式对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤具有一定的保护作用, 抑制了细胞凋亡，抑制NF-B的核移位。

关键词： 人参皂苷R4； PC12细胞； 帕金森； 剂量依赖

Abstract: To study the protective mechanism of ginsenoside R4 on PC12 cells damaged by 6-OHDA. The cell viability of PC12 cells treated with different concentrations of ginsenoside R4 was compared with that treated with 6-OHDA. Referring to the cell viability detected by MTT method, it was concluded that 6-OHDA could significantly reduce the cell viability, while ginsenoside R4 could inhibit the cell viability after 6-OHDA treatment. Apoptosis and damage of PC12 cells were decreased after treatment with ginsenoside R4. Western blotting showed that the expression levels of caspase-3, Caspase-8 and caspase-9 in PC12 cells treated with 6-OHDA were higher than those in normal cells. On the contrary, the expression levels of caspase family proteins were decreased by pretreatment with ginsenoside R4 in an activation-dependent manner. Similarly, Bax protein expression and caspase family proteins were also decreased by pretreatment with ginsenoside R4. The pase family protein levels were the same. Ginsenoside R4 has a protective effect on PC12 cell injury induced by 6-OHDA in a dose-dependent manner.

Key words: Ginsenoside R4; PC12 cells; Parkinson; Dose-dependent

目录

1 前言 6

1.1帕金森 6

1.1.1帕金森概述 6

1.1.2帕金森研究方向 6

1.2人参皂苷 7

1.2.1人参皂苷R4 7

1.3本实验的研究目的和意义 7

2 材料与方法 7

2.1材料与试剂 7

2.2实验器材 7

2.3 试验方法 8

2.3.1 细胞培养 8

2.3.2细胞活力 8

2.3.3 细胞形态分析 8

2.3.4 免疫荧光法和DAPI染色法 8

2.3.5 蛋白质印迹法 8

3 结果与讨论 10

3.1 人参皂苷R4和6-OHDA对PC12细胞活力的影响 10

3.2 人参皂苷R4对6-OHDA诱导PC12细胞形态的影响 11

3.3 人参皂苷R4对6-OHDA诱导细胞凋亡的影响 12

3.4 人参皂苷R4对核转录因子表达的影响 13

4结论 15

参考文献 16

1 前言

1.1帕金森

1.1.1帕金森概述

帕金森病是一种较为常见的神经系统变性疾病^[1]，主要发病年龄在60岁以上，但40岁时已有较大发病可能。疾病的发生通常伴随着黑质致密部多巴胺能神经元的进行性变性导致多巴胺含量降低^[2]。帕金森的一些非运动型症状，如认知障碍、抑郁、心情烦躁和易爆易怒，严重妨碍了得病患者的正常生活。

1.1.2帕金森研究方向

尽管近些年人们越来越关注局部放电，但我们仍然不完全清楚局部放电发病导致的潜在病因。明确帕金森病的发病机制，对于探索新的抗帕金森药物，开发安全有效的治疗帕金森病方法具有重要意义。积累的证据表明年龄、线粒体功能障碍、细胞凋亡和氧化应激是促进其发病的主要因素^[3]。其中氧化应激可诱发和加重细胞凋亡。除细胞凋亡外，蛋白质、脂质、DNA和糖原的变化也是由氧化应激引起的。

氧化应激是由于自由基积累和超氧化歧化物（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的低效性而引起的。越来越多的数据解释了活性氧（ROS）影响了许多高度复杂的信号通路。因此，我们应该集中更多的精力去开发新的抗氧化剂。

1.2人参皂苷

1.2.1人参皂苷R4

人参是一种中药，被称为“万灵药”。人参皂苷是天然活性成分人参，具有许多药理作用，如神经保护，抗肿瘤，抗癌，抗炎，抗衰老，抗休克等^[4]。人参皂苷R4是人参中含有多种药理成分的甾体类天然代谢产物之一。迄今为止，已分离鉴定出近150种人参皂苷。而人参皂苷R4在人参中的发现较早，但对其研究较少，其在PD中的作用及具体的分子机制尚不清楚。

1.3本实验的研究目的和意义

为了确定几种新型药物干预的效果和潜在机制，利用体外细胞模型可以提供令人信服的治疗见解。由于多巴胺神经递质的分泌，不同的PC12细胞被广泛应用于体外神经疾病的研究中。6-OHDA是儿茶酚胺的羟基衍生物，其结构与儿茶酚胺相似。此外，6-OHDA作为一种神经毒素能对多巴胺神经元产生损伤，常用于PD模型的诱导^[5]。在最新的研究中，我们首次研究了R4是否能在6-OHDA诱导的PC12细胞的营养保护作用中起关键作用，并对R4介导的可能信号通路进行了表征。本研究旨在探讨一种合适的局部放电治疗方法，为研制和推广R4提供依据。

2 材料与方法

2.1材料与试剂

6-羟基多巴胺氢溴酸盐（6-OHDA）购自Sigma AloRich（含量：95%，美国密苏里州圣路易斯）;磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自Amresco; FBS、HS、MTT、山羊抗兔LGG Hamp;L（HRP）AB6721、caspase-3（casp3）抗体购自Abcam。

2.2实验器材

全自动高压灭菌器（美国Zealway公司），CO2细胞培养箱（日本SANYO公司），倒置荧光显微镜（日本OLYPUS公司），酶标仪（瑞士Tecan公司），流式细胞仪（美国BD 公司），凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司），显微镜（Olympic）。

2.3 试验方法

2.3.1 细胞培养

神经分化大鼠嗜铬细胞瘤PC12的细胞培养通常保存在DMEM完全培养基中^[6]，在37°C下添加5% HS、10% FBS、100U/ml青霉素和100 g/ml链霉素，并在含有5% CO2的湿润培养箱中培养。当PC12细胞70%-80%融合时，处理细胞，每周更换2-3次培养基。

2.3.2细胞活力

PC12细胞在96孔细胞培养板上以3×10⁵细胞/ml接种过夜。然后分别用浓度增加的R4（0-200μM）和6-OHDA（0-300μM）培养细胞。处理24小时后，加入最终浓度为0.5 mg/ml的MTT （含10% SDS和0.01M HCl的停止溶液）4小时，16-20小时后，用酶标仪检测到550nm处的吸光度。为了确定R4的神经保护作用，用R4（25、50或100μM）预处理细胞30分钟，然后以适当浓度暴露于6-OHDA中24小时。如前所述，研究细胞存活率。

2.3.3 细胞形态分析

PC12细胞在3×10⁵细胞/孔的无菌盖玻片上生长，培养过夜。然后用R4和6-OHDA在二氧化碳培养箱中处理24小时，用显微镜观察细胞形态。并在扫描电镜下观察了组织的变化。处理后的细胞用PBS洗涤三次，室温下用2.5%戊二醛溶液固定1小时。随后，用PBS再次冲洗细胞三次，然后用分级乙醇（30%、50%、70%、90%、100%）脱水两次，每次5分钟。在扫描电镜下拍摄PC12细胞的显微照片。

2.3.4 免疫荧光法和DAPI染色法

免疫荧光法和DAPI染色法观察转录因子NF-B的核易位。用R4和6-OHDA处理后，用冷PBS洗涤3次，用4%聚甲醛固定，0.5%TRiton X-100渗透10分钟，3% BSA在PBS中阻断1小时，用1:1000的原代抗体NF-B p65（1:1000）孵育，用3% BSA在PBS中稀释。三次冲洗后，用非特异性抗体驴兔染色。用DAPI染色法测定核形态

2.3.5 蛋白质印迹法

（1）将电泳需要的玻璃板，安装在器材上。

（2）制作好的分离胶灌入玻璃板中，用适量（大概一厘米高）异丙醇封好，等待大概30分钟凝固。

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