耐铬啤酒酵母的诱变选育及富铬啤酒的生产工艺设计

论文总字数：17837字

摘 要

采用紫外线诱变法对啤酒酵母进行诱变。结果表明，在功率为15W、照射距离为35cm的紫外灯照射下，当诱变时间为80s时，致死率达到75%。筛选出6株强聚耐铬的酵母菌，其中Z-38号菌株生物量达到0.25 g/100mL，有机铬含量达到6.7 mg/g，比诱变前提高了1.58倍。筛选出的耐铬啤酒酵母经扩大培养后，作为富铬啤酒生产的酵母菌进行年产400吨12°P富铬啤酒生产工艺的设计。采用下面发酵法进行啤酒酿造，发酵周期为22天。

关键词：紫外线诱变，铬酵母，富铬啤酒，发酵

Abstract：Ultraviolet mutagenesis was used to mutagenesis beer yeast. The results showed that the lethality rate reached 75% when the mutagenesis time was 80s under the irradiation of ultraviolet lamp with power of 15W and distance of 35cm.Six strains of chromium-tolerant yeasts were screened out. The biomass of strain Z-38 was 0.25 g/100mL and the content of organic chromium was 6.7 mg/g, which was 1.58 times higher than that before mutagenesis. The chromium-tolerant beer yeast was screened out and cultured extensively. As a chromium-rich beer yeast, the production process of chromium-rich beer with an annual output of 400 tons and 12 degrees P was designed. The following fermentation method was used to brew beer. The fermentation period was 22 days.

Keywords：Ultraviolet mutagenesis, chromium yeast, chromium-rich beer, fermentation

1. 前言

微量元素铬在人体内的含量虽然不多，但却发挥着重要作用，因为它是我们体内葡萄糖耐量因子所需的重要成分^[1,2]。若是人体内缺乏铬元素，就会产生葡萄糖、蛋白质、脂肪代谢障碍，从而引发各种疾病，如糖尿病，末梢神经炎，动脉粥样硬化，冠心病等^[3]。人们主要从食物、空气即饮水中摄取，每天的需要量是 0.005～ 0.2mg，铬在人体内的含量约为5－10mg。

富铬酵母中的有机铬的生物活性较高，使人体内的糖代谢、脂肪代谢有所改善，具有降糖、降脂^[4,5]的功能特点。潘性源等^[6]选用生长状况良好的大鼠作为实验对象，四氧嘧啶作为注射试剂，对大鼠进行静脉注射。将静脉注射后的大鼠分开饲养，各组大鼠喂食不同剂量的富铬酵母，之后测量大鼠体内糖的含量，发现具有降糖效果。刘明等^[7]为了证明食用富铬酵母能够降脂，进行了动物实验。

目前，富铬酵母已经遍及多个行业，在食品、医学、饲养行业应用最为广泛。

在食品方面，富铬酵母不仅有机铬的含量丰富，而且还含有其它人体所需的营养物质，如蛋白质、核酸等。富铬酵母可以作为烘焙食品的添加剂，将它添加到烘焙食品中提高食品的营养价值；添加到熟食、冷冻食品中，来改善风味；在豆乳、牛乳中加入，可制成降糖奶粉和豆乳粉^[8]。

在预防医学方面，富铬酵母可以预防某些疾病，如粥样动脉硬化。它还能够使核酸的三级结构不易被破坏，由于RNA受热会变性，富铬酵母的使用会起到一定的防护作用。除此之外，它对人体内的神经系统具有保护作用^[9]。

在饲养行业方面，富铬酵母可作为饲料添加剂，可以提高动物体内合成蛋白质的能力。其中肌蛋白的合成能力大大提高，脂肪沉积率明显下降。从而保证了肉类的质量，瘦肉的含量较之前有了大幅度的上升^[10]。

啤酒具有美容、解渴、提神、助消化、利尿等功效，是人们日常喜欢的饮料之一。本课题通过紫外线诱变筛选出耐受铬的啤酒酵母用于富铬啤酒的发酵，使啤酒中富含人体能够接受的铬浓度，让喜爱喝啤酒的人们在享受啤酒爽口风味的同时，摄取到一定量的铬，预防疾病。

2. 耐铬啤酒酵母的诱变选育

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 试验菌种

淮阴师范学院生科院实验室所购买的安琪高活性干酵母。

2.1.1.2 试验仪器

2.1.1.3 培养基

液体培养基：酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L。

平板培养基：成分同液体培养基，另外加入琼脂粉20g/L。

斜面培养基：成分与平板培养基相同。

筛选培养基：在平板培养基的基础上加入不同浓度的Cr3 。

发酵培养基：成分同液体培养基，另加入900μg/mL的Cr3 。

2.1.2 方法

2.1.2.1 菌种活化与纯化

称取实验室的安琪活性干酵母5g，按照1：10的比例加入50ml的温水中，用玻璃杯搅拌均匀后静置。25分钟后，移液枪吸取2ml菌液到100ml的液体培养基中，设置摇床温度为30℃，转速为150r/min摇36h。超净工作台内进行平板划线操作，目的是获得单菌落用于纯化。将划线后的平板置于28℃的恒温培养箱，2d后观察菌落的长势，挑取生长状况优良的单菌落平板划线。划线后的平板放人恒温培养箱，设置培养箱的温度为28℃，培养2d后获得纯化好的菌种。纯化好的菌在试管斜面上划线，恒温箱培养36h后冰箱保存。

2.1.2.2 酵母细胞悬液的制备

取出一只冰箱保存菌种的试管放入超净工作台。超净工作台中将一个已灭菌的离心管加入适量无菌水，然后用接种环挑取一环菌在离心管中震荡混匀。用10倍稀释法将离心管中的菌液稀释到合适的浓度，酵母细胞悬液制备完成。

2.1.2.3 紫外线诱变

本试验设紫外线照射时间为20s,40s,60s,80s,90s,100s,120s,150s。用移液枪吸取20μl的酵母细胞悬液进行平板涂布，为了保证实验结果准确，每个诱变时长涂3个平板。每3个平板为一组在紫外灯下35cm处照射，每个时间段照射完成后将平板用黑布裹好放入恒温培养箱。为了防止出现光复活现象，需在黑暗条件下培养。2d后取出平板进行菌落计数。

设对照平板上的活菌数为m，紫外照射后平板上的活菌数为n。

致死率=[(m-n)/m]×100%

2.1.2.4 平板初筛

挑取致死率在70%～80%平板上菌落大且边缘整齐的单菌落，在试管斜面培养基上划线培养。试验共挑取50个单菌株，培养36h，然后分别在含Cr³ 含量为600、700、800、900μg/mL（m/v）的平板上划线培养36h。根据酵母菌的生长情况，将能够在较高铬浓度平板上生长的菌株筛选出来，作为能够耐受铬的突变菌株。然后在试管斜面培养基上培养之后，保存于冰箱，进行复筛。

2.1.2.5 摇瓶复筛

取出冰箱内的强聚耐铬酵母，挑取一环菌接种到含100 ml发酵培养基的摇瓶中。同时原始菌株也需进行相同操作。设置摇床温度为30 ℃，转速为150 r/min，将摇瓶放入培养2 d。取出摇瓶进行离心、清洗、干燥后测定其生物量、铬含量。并将强聚耐铬酵母菌株的测得量与原始菌株的测得量进行比较。

2.1.2.6 生物量的测定

取40 mL发酵所得的菌液于离心管中，5000 r/min离心5 min，倒掉上清液。加入一定量的无菌水，振荡，再离心。重复此清洗步骤2次，即可获得干净的富铬酵母。将装有富铬酵母的离心管置于55 ℃的烘箱进行干燥，冷却后称重并推算出100 mL菌液的生物量，即为酵母生物量。

2.1.2.7 有机铬含量的测定

采用二苯胺基脲法测定酵母中铬含量^[11,12]。铬酵母经干法灰化后进行测定，即为铬酵母中的总铬含量；采用静置浸出离心分离法测定铬酵母中无机铬的含量^[13,14]。

有机铬含量 (μg/g(m /m))=总铬含量 (μg/g)－无机铬含量 (μg/g)

2.2 结果与分析

2.2.1 紫外线诱变结果及致死曲线的绘制

表 2.2.1 紫外诱变后计数结果与致死率

处理时间/s	菌落数/（个/ml）			平均数/（个/ml）	致死率%
	平板1	平板2	平板3
0	2.46×105	2.48×105	2.51×105	2.48×105	0
20	2.04×105	2.01×105	1.98×105	2.01×105	18.95
40	1.48×105	1.56×105	1.58×105	1.54×105	37.90
60	1.16×105	1.08×105	1.02×105	1.09×105	56.05
80	6.1×104	5.8×104	6.6×104	6.2×104	75
90	4.9×104	4.3×104	5.1×104	4.8×104	80.65
100	1.4×104	1.8×104	1.1×104	1.4×104	94.35
120	3×103	6×103	8×103	5.7×103	97.70
150	2×103	3×103	2×103	2.3×103	99.07

由表 2.2.1 可见随着照射时间的不断增加，致死率逐步上升。20s以内，酵母菌的活菌数较多，说明短时间的紫外照射，对酵母菌没有造成很大影响。长时间的紫外照射，酵母菌死亡率较高，80s时，致死率达到75%。当照射时间为150s时，致死率为99.07%，接近百分百，所以大致确定本实验的酵母菌对紫外线的最长耐受时间为150s。

根据算得的致死率画出致死率曲线，结果见图2.2.1：

图 2.2.1 致死率曲线

从图 2.2.1 可见，随着照射时间的增加，致死率不断提高。根据致死率曲线，确定合适的致死率，选择致死率在70％～80％的平板（诱变时间在80s～90s的平板），挑取平板上菌落大，边缘整齐的单菌落，共挑取50个单菌株进行筛选。

2.2.2 初筛结果

通过对50个菌株的平板筛选，获得能在较高铬浓度平板上生长的菌株6株，分别为Z-3号菌株，Z-11号菌株，Z-23号菌株，Z-31号菌株，Z-38号菌株，Z-45号菌株。这6株菌株都能在Cr³ 含量为900μg/mL的平板上生长，切生长良好，说明能耐铬能力很强，可作为复筛使用。故在试管斜面培养基上培养之后，冰箱低温保存以便复筛使用。

2.2.3 生物量与有机铬含量测定结果

通过对6株菌种原始菌株Z-YS进行摇床培养后测定其生物量，有机铬含量，结果如下：

表2.2.2生物量与有机铬含量测定结果

菌种	生物量（g/100mL）	有机铬含量（mg/g）	有机铬含量比对照提高倍数
Z-YS	0.23	2.6	0
Z-3	0.28	3.7	0.42
Z-11	0.25	5.8	1.23
Z-23	0.19	4.2	0.62
Z-31	0.23	5.3	1.04
Z-38	0.25	6.7	1.58
Z-45	0.18	3.9	0.50

从表 2.2.2 中可知，这6株酵母菌株与原始菌株相比生物量并没有很大差异，而有机铬含量却有所提高，其中Z-38号菌株有机铬含量达到6.7 mg/g，比诱变前提高了1.58倍，故确定Z-38号菌株作为生产富铬啤酒的酵母菌株。将Z-38号酵母菌株进行扩大培养，用于富铬啤酒生产。

3 富铬啤酒生产工艺设计

3.1 设计的概述

3.1.1 设计依据

根据淮阴师范学院生命科学学院下发的毕业设计大纲进行设计。

3.1.2 设计指导思想

要求设计出来的啤酒厂生产成本低、投资小、运行稳定、技术高、易管理、环境好。在工艺流程上，要求设计合理；在设备上，为了提高生产率，采用机械化、自动化的先进技术进行生产。在经济方面，满足产品质量的前提下要尽量降低生产成本，做到资源的充分利用，能够重复利用的可回收利用，减少浪费。

3.1.3 设计内容

本设计内容为年产400吨12°P的富铬啤酒生产工艺，从原料的选择到生产工艺的确定，其中发酵方法的选择为重点。设计还包括物料衡算、耗冷量的计算、发酵罐的设计、辅助设备的选型等。

3.1.4 厂址的选择

厂址选择要考虑微生物发酵对环境的要求，生产过程中对水的需求量较大，所以要有充足的水源。地势要求平坦，有利于交通运输和生产废弃物的处理。综合上述条件，城镇的郊区基本满足。

3.1.5 工艺的选择

1.保证啤酒的质量符合国家的标准。

2.采用先进的生产设备以及成熟的生产技术。

3.依据原料种类，性质来确定生产方法。

3.2 啤酒生产工艺的选择及论证

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：17837字