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摘 要

当前液体燃料乙醇的重要突破点是将纤维素转化成可用微生物对其进行发酵的单糖，尤其是对其进行低成本且高效率的转化。研究表明，在纤维素酶的诱导表达以及酶活性中，可由里氏木霉生产的木聚糖酶起到了重要作用。本实验主要以根癌农杆菌EHA105为研究对象，优化了制备EHA105感受态细胞的条件并完成了质粒Pact-Xyn2-pCAMBIA

1300的转化且对转化条件进行了优化。结果显示，在选用YEB培养基和浓度为10mM的CaCl₂溶液条件下制备的感受态细胞转化率较高。将质粒Pact-Xyn2-pCAMBIA1300转化进优化条件下制备的感受态细胞并对几个影响因子进行优化，感受态细胞与质粒DNA在共置时间为30min，并用液氮处理后，热激温度为37℃时转化率最高，为1.5×10⁵μg^-1。这将为真菌的高效转化提供有效理论基础。

关键词：根癌农杆菌；感受态细胞；质粒Pact-Xyn2-pCAMBIA1300 ；转化率

Abstract：An important breakthrough point of current liquid fuel ethanol is the conversion of cellulose into monosaccharides that can be fermented by microorganisms,especially for its low-cost and high-efficiency conversion.Studies have shown that xylanase produced by Trichoderma reesei plays an important role in the induction of cellulase expression and enzyme activity.In this experiment, the Agrobacterium tumefaciens EHA105 was mainly used as research object.The conditions for the preparation of EHA105 competent cells were optimized and the plasmid Pact-Xyn2-pCAMBIA was completed

1300 conversions and optimization of conversion conditions.The results showed that the conversion rate of competent cells prepared under the condition of using YEB medium and CaCl₂ solution with a concentration of 10 mM was higher.The plasmid Pact-Xyn2-pCAMBIA1300 was transformed into competent cells prepared under optimized conditions and several factors were optimized.Competent cells and plasmid DNA in the co-location time of 30min,After treatment with liquid nitrogen,heat shock temperature The highest transformation rate was 1.5×10⁵ μg^-1 at 37°C. This will provide an effective theoretical basis for the efficient transformation of fungi.

Key words: Agrobacterium tumefaciens; competent cell; plasmid Pact-Xyn2-pCAMBIA1300; transformation frequency

目 录

1 前言 1

2 实验材料 2

2.1 菌株与质粒 2

2.2 试剂 2

2.3仪器 2

3 实验方法与具体过程 2

3.1培养基的配置 2

3.1.1 LB培养基的配制 2

3.1.2 YEB培养基的配制 3

3.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备 3

3.3质粒pUC18的转化 3

3.4培养基的优化 3

3.5 CaCl₂溶液浓度的优化 3

3.6 Pact-Xyn2-pCAMBIA1300质粒转化农杆菌 4

3.7质粒DNA与感受态细胞共放置时间的优化 4

3.8冰冻方式的优化 4

3.9热激温度的优化 4

3.10转化子的鉴定 4

3.10.1抗性单菌落培养 4

3.10.2提取质粒DNA 4

3.10.3抗性单菌落及质粒DNA PCR 4

3.10.4琼脂糖凝胶成像 5

4 结果与分析 5

4.1 1μg pUC18转化 5

4.2 1μg Pact-Xyn2-pCAMBIA1300转化 5

4.3 培养基的优化 5

4.4 CaCl₂浓度的优化 6

4.5 质粒与感受态细胞共同放置时间的优化 7

4.6冷冻方式的优化 9

4.7热激温度的优化 9

4.8农杆菌转化子的鉴定 10

结 论 12

参考文献 13

致 谢 15

1 前言

为了应对当前全球的能源危机问题，使用液体燃料乙醇去替代化石燃料，因此国内外研发生物乙醇已成为当今热点^[1]。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，目前还没被开发利用的有八成左右，绝大部分此类材料都被视作废物而未被利用。这不但造成资源上的浪费，且会令环境严重污染。

纤维素酶是一组酶的总称，极低的生产以及使用效率是影响木质纤维资源生物转化的最大障碍。相比酸解法和碱解法，选用酶解法来降解纤维素是一种合理且低成本的方法^[2-4]。

丝状真菌^[5]是自然界中降解木质纤维素的主要微生物，里氏木霉RutC-30由于具有产酶量高等特点成为许多提高纤维素酶产量的微生物实验的材料。当前作为纤维素酶解的突破点问题之一是木聚糖酶的表达和其酶活。

半纤维素在植物的光合产物中，其所占比例比淀粉和纤维素稍低一些。木聚糖（xylan）作为植物半纤维素的重要组成部分，是一种多聚五碳糖^[6]。木聚糖酶I(Xyn1)和木聚糖酶II(Xyn2)是编码木聚糖降解酶主要基因，其作用效果相似而Xyn2的酶活性高出很多^[7]。木聚糖酶在早期还没有广泛运用，随基因重组技术的发展，大幅度提高其表达量很有可能实现，其基因工程研究已成为热点^[8]。

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