论文总字数：9978字

摘 要

在真菌遗传转化中常使用根癌农杆菌介导法。本研究拟对农杆菌感受态制备条件、转化条件进行优化以提高转化率。在农杆菌过程中，通过测量菌液OD₆₀₀值监测菌体数量，制备感受态过程中选用不同浓度CaCl₂溶液处理菌体，转化过程中用液氮及热激进行不同时间的处理。转化成功后记录转化子的个数并鉴定其阳性，从而确定转化效率的高低。实验结果表明，将农杆菌培养14~16 h后，农杆菌的活力最强；当CaCl₂ 溶 液浓度为8 mmol·L^-1 时制 备的感受态细 胞接受外源DNA能力最好；制备好的感受态细 胞液 氮速冻5 min，37℃热激转化率最高，达6.21×10⁵ μg^-1。优化转化条件，提高转化效率，为下一步真菌的功能基因的研究以及真菌表达系统的开发打下坚实的基础。

关键词：农杆菌，感受态细胞，转化效率

Abstract：Agrobacterium tumefaciens-mediated methods are often used in genetic transformation of fungi.This study intends to optimize the conditions for the preparation and transformation of Agrobacterium tumefaciens to increase the conversion rate.In the Agrobacterium process, the number of bacteria was monitored by measuring the OD₆₀₀ value of the broth,during the preparation of the competent cell, different concentrations of CaCl₂ solution were used to treat the bacteria. During the transformation process, liquid nitrogen and heat shock were used to treat the bacteria at different times.After successful transformation, the number of transformants was recorded and identified as positive, thereby determining the conversion efficiency.The experimental results show that Agrobacterium has the strongest vigor after cultured for 14-16 h.When the concentration of CaCl₂ solution was 8 mmol·L^-1, the competent cells prepared had the best ability to accept exogenous DNA.The prepared competent cells were quickly frozen in nitrogen for 5 min and the highest rate of heat shock conversion at 37℃ was 6.21×10⁵μg^-1.Optimizing the transformation conditions and improving the transformation efficiency will lay a solid foundation for the next step in the study of functional genes of fungi and the development of fungal expression systems.

Keywords：Agrobacterium tumefaciens，competent cell，efficiency of transformation

目录

1 前言 1

2 材料与方法 2

2.1 材料 2

2.2 实验步骤 2

3 结果与分析 4

3.1确定根癌农杆菌的最佳生长状态 4

3.2 不同浓度CaCl2转化溶液制备感受态细胞对转化率的影响 5

3.3 液氮速冻时间及热激条件对转化率的影响 7

3.4 转化结果鉴定 7

结论 9

参考文献 11

致 谢 12

1 前言

植物细胞壁主要由纤维素构成， 而纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖。纤维素占植物界碳含量的50%以上，是自然赠与人类的财富，取之不尽用之不竭的可再生资源。纤维素广泛应用于食品加工、炼油、禽畜饲料加工等各个与日常生活息息相关的行业和领域。但纤维素不溶于水及一般有机溶剂，在生产中很难被直接利用。农业生产中产生的大量农作物秸秆，主要成分就是纤维素，广大农民处理秸秆的一般方法是焚烧或者作为畜牧饲料。而焚烧秸秆会造成严重的空气污染还有很大的安全隐患，且通过焚烧秸秆将养分还田这种方法效率还很差。农作物最为常见禽畜饲料含有大量纤维素，许多禽畜比如猪、鸡等单胃动物不能直接利用纤维素。

纤维素酶能降解纤维素生成葡萄糖，在很多以纤维素作为原料的行业，在生产中大量使用纤维素酶，以提高纤维素的利用率。纤维素酶是一种复合酶，主要构成是外切β-葡 聚 糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄 糖苷酶等。

里氏木霉(Trichoderma reesei) 是目前较为高效的生产酶类的工业菌株，在合适的诱导条件下，可以很大量合成并高效生产纤维素酶，它分泌到每升发酵液中的蛋白总量可达100g^[1]。里氏木霉分泌的纤维素酶中不同组分的酶含量有差异，外切β-葡聚糖酶和内切β- 葡 聚糖酶含量较大，而 β -葡萄糖苷酶含量较少，β -葡萄 糖苷酶含量对纤维素酶的降解效力影响很大。

本实验中目的基因Cel1b可以改良里氏木霉，提高里氏木霉的β-葡萄糖苷酶产量，通过遗传转化将目的基因导入到其细胞内是利用里氏木霉表达蛋白的前提。对里氏木霉进行转化最经常使用的方式是原生质体转化法^[2]。但在使用这种方法对木霉进行转化时，制备和再生原生质体的过程极其复杂和费时，而且比较容易受一些外因的影响，导致转化的效率很低。

根癌农杆菌介导转化法(ATMT)是一种良好的基因工程研究的工具，在丝状真菌的转化中愈来愈受到重视。传统的原生质体转化法在对里氏木霉的转化中需要制备原生质体，而农杆菌介导法对里氏木霉的转化可以直接以孢子作为转化受体，很大程度上简化了操作。在丝状真菌的转化中农杆菌转化法获得越来越多的运用，现在已经由农杆菌转化法成功地对60多种丝状真菌实现了转化^[3]，包括本实验使用的里氏木霉。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：9978字