微生物法提高药物手性中间体立体选择性的研究

论文总字数：7736字

摘 要

(S)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲醇，其分子式为C₁₄N₂₁ClN₂O，是一种用于合成新一代抗组胺药物倍他司汀的重要手性中间体。在不对称还原(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲酮（CPMK）生成(S)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲醇[(S)-CPMA]的反应中用具有羰基还原酶的酵母细胞做催化，进而研究预热处理微生物、添加辅助底物、控制微生物细胞的生理状态、选择合适的反应溶剂、添加辅酶等条件对反应产物(S)-CPMA产率的影响。结果表明，常温条件下，菌种浓度为50 g/L，底物浓度为2 g/L时，添加5%葡萄糖作为辅助底物和0.1%的还原型辅酶Ⅱ（NaDPH），在水相体系中进行羰基还原反应，条件最优，产品纯度达到89.2%。

关键词：羰基还原酶，优化，(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲酮

目录

1 前言 4

2 材料和方法 5

2.1材料 5

2.1.1菌种 5

2.1.2试剂 5

2.1.3主要培养基 5

2.1.4仪器 5

2.2方法 6

2.2.1菌种的培养 6

2.2.2转化反应 6

2.2.3高效液相色谱检测 6

2.2.4反应产物e.e值和剩余底物的计算 7

3 结果与讨论 7

3.1反应立体选择性的初步检测方法 7

3.2改变条件对反应立体选择性的影响 8

3.2.1预热处理微生物对催化不对称还原立体选择性的影响 8

3.2.2添加辅助底物对催化不对称还原立体选择性的影响 9

3.2.3控制微生物细胞的生理状态对催化不对称还原立体选择性影响 10

3.2.4选择合适的反应溶剂对催化不对称还原立体选择性的影响 11

3.2.5添加辅酶对催化不对称还原立体选择性的影响 12

结论 14

参考文献 15

致谢 16

1 前言

1864年，巴斯德发现了Acetobacter sp.（乙酸杆菌）能将乙醇氧化为乙酸，使人们能用纯菌种乙酸杆菌将乙醇氧化为乙酸后，人类才开始了通过微生物方法合成化学物质的研究道路^[1-2]。利用微生物作用的方式来进行某种化学反应称之为微生物转化反应^[1]。

人们通过对手性药物进行药理作用研究后发现，两种对映异构体可能具有以下三种不同的生物活性：1、具有类似的生理活性；2、一种对映异构体具有所需的生理活性，另一种没有显著的生理活性；3、各对映异构体具有不同或完全相反的生理活性^[3]。正是因为这一特点，对手性药物的研究越来越深入^[10]。现代社会人们对于健康愈来愈重视，科学和技术的发展，使得人们对于药物的药效及安全性有了更高的要求。而微生物法提高药物手性中间体立体选择性或将成为手性药物生产突破的关键性技术^[4]。微生物法手性合成的优势体现在以下几个方面^[5]：

1、对合成手性药物来讲，具备严酷的立体布局选择性十分重要。有机化学合成方法在产物对映异构体的筛分方面并不具备优势^[6]，而微生物转化反应具备高度的立体选择性，是一种绿色高效的合成手性药物的方法。

2、微生物法的转化条件温和，设备简单，因此是较为安全便利的转化方法。

3、微生物转化反应属于酶催化反应的一种，在最始条件下，反应速率较快。

4、微生物转化反应的专一性高，副反应少，相较于有机合成反应来说少了许多分离纯化步骤，极大的节省了人力、物资成本，具有极大的工业优势^[12]。

(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇[(S)-CPMA]是一种用于合成抗组胺药物倍他司汀的重要手性中间体^[7]。本实验通过研究菌株催化不对称还原(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲酮（CPMK）生成(S)-CPMA的反应条件，考察了预热处理微生物、添加辅助底物、控制微生物细胞的生理状态、选择合适的反应溶剂、添加辅酶等是否能优化羰基还原反应^[7]。

用微生物法对（4-氯苯基）（吡啶-2-基）甲酮（CPMK）进行不对称还原制备(S)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲醇[(S)-CPMA]的合成路线^[7]见图 1：

粘红酵母

图 1：CPMK（a）不对称还原合成（S)-CPMA（b）路线图

2 材料和方法

2.1材料

2.1.1菌种

实验室自行筛选用的粘红酵母（Rhodotoruba glutirus h2）

2.1.2试剂

（1）甘油、蔗糖、甲醇、乙醇、异丙醇、正己烷、苯、乙酸乙酯；

（2）生理盐水：每100 mL蒸馏水中含0.85 g氯化钠；

（3）磷酸缓冲液（0.2 M）

甲液：二水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）：Mr=156.03，0.2 mol/L溶液为31.21 g/L

乙液：十二二水合磷酸二氢钠（Na₂HPO₄·12H₂O）：Mr=358.22，0.2 mol/L溶液为71.64 g/L。

配置pH=7的磷酸缓冲液，取39 mL 甲液与61 mL 乙液混合均匀即可。

2.1.3主要培养基

1. 丰富平板培养基（g/L）

葡萄糖 25，酵母膏 10，磷酸二氢钾 4，七水合硫酸镁 1.5，琼脂 20。

1. 发酵培养基（g/L）

葡萄糖 50，酵母膏 20，磷酸二氢钾 4，七水合硫酸镁 1.5。

2.1.4仪器

表一：实验所用主要仪器型号及厂家

仪器	型号	厂家
立式高压蒸汽灭菌锅	LS-75LD	万科实验仪器
生化培养箱	LRH-250F	上海捷呈
超净工作台	BSC-1500IIA2-X	济南鑫贝西生物技术有限公司
恒温摇瓶柜	HZ-2010KA	太仓华利达实验室设备公司
高效液相色谱HPLC	LC600A	南京科捷分析仪器有限公司
高速离心机	TG20G	金坛市城西春兰实验仪器厂
分析天平	FA2104S	广州市予华仪器有限公司

2.2方法

2.2.1菌种的培养

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