不同温度和pH值对里氏木霉产纤维素酶的影响的研究

论文总字数：14275字

摘 要

里氏木霉的纤维素酶是一类诱导酶类，在诱导因素下，里氏木霉根据纤维素酶的合成机理合成和表达纤维素酶。但不同的诱导条件下，纤维素酶的合成和表达机理并不完全相同。本实验以温度24℃、27℃、30℃、33℃、36℃为起始培养的温度，培养里氏木霉并测定酶活变化；以起始培养基pH3、pH4、pH5、pH6培养里氏木霉，分别取培养基上清酶液，测定酶活变化。实验结果显示，在温度30℃条件下，pH4酶活相对最高，酶活为5.25U/ml。

关 键 词：里氏木霉，纤维素酶，温度，pH值，酶活

Abstract：Cellulases from Trichoderma reesei are induced enzymes. With the induced factors, T. reesei expresses cellulase with the synthetic mechanism of cellulases. But under the condition of different inductors, synthesis and expression mechanism of cellulase is not exactly the same. This thesis is trying to determine the optimal fermentation temperature by checking the cellulase activity under the fermentation temperature of 24 ℃, 27 ℃, 30 ℃, 33 ℃ and 36 ℃. This thesis also checked the optimal fermentation pH by monitor the cellulase activity under the fermentation pH of pH3, pH4, pH5, pH6. The experimental results showed that under the condition of the temperature is 30℃ and pH4, cellulase enzyme activity is relatively high, the enzyme activity is 5.25 U/ml.

Key words: Trichoderma reesei, cellulase enzyme, temperature, pH value, enzyme activity

目 录

1 前言 2

2 里氏木霉产纤维素酶的诱导剂的研究 2

2.1材料与仪器 2

2.1.1 PDA培养基 3

2.1.1.1 试剂和材料 3

2.1.2 种子培养基 3

2.1.2.1 玉米浆种子培养基 4

2.1.2.2 基本培养基 4

2.1.2.3 DNS配制 4

2.1.2.4 DNS溶液检验 4

2.1.2.5 柠檬酸缓冲液 5

3 接种方法以及培养 5

3.1 菌种制备 5

3.2 纤维素酶制备 5

3.3 酶活的测定 5

3.3.1 葡萄糖标准曲线 5

3.3.2 滤纸酶活的测定 6

3.4 酶活计算方法 6

4 结果分析 7

4.1 葡萄糖标准曲线 7

4.2 不同的温度条件及pH值对里氏木霉产纤维素酶的影响 7

4.2.1 温度条件为24℃ 7

4.2.2 温度条件为27℃ 9

4.2.3 温度条件为30℃ 10

4.2.4 温度条件为33℃ 11

4.2.5 温度条件为36℃ 12

结 论 14

参 考 文 献 15

致 谢 16

1 前言

纤维素是地球上数量最大的可再生能源物质，中国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有20亿t^[1-3]。但由于其木质纤维素含量高，生物降解缓慢，目前对其利用率不高。近年来对纤维素降解方面的研究最经济、环保的方法就是生物降解^[4]。利用微生物或其产生的纤维素酶可将纤维素酶解为低分子量的己糖或戊糖，用于生产新型饲料、单细胞蛋白等，将缓解人类面临的粮食、能源及环境危机。

里氏木霉是一种嗜热丝状腐生真菌，是多细胞的真核微生物，隶属于丛梗孢目木霉属。作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类。被广泛应用于生产食品、饲料、纺织、制浆和造纸等行业用纤维素和半纤维素酶。里氏木霉的菌落呈广铺的棉絮状，起初为白色致密的平坦菌丝，而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区，反面无色。分生孢子梗菌丝的短侧枝，多分枝，多为椭圆形或长方形，透明，壁光滑，成堆时绿色。

里氏木霉所产生的一种主要的纤维酶一纤维二糖水解酶I，由单拷贝基因编码，其产量可达里氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50%^[5]。因此，在对里氏木霉的遗传改造中，常利用纤维二糖水解酶I的启动子与终止子序列构建载体，并利用纤维二糖水解酶I的前导肽序列引导重组蛋白进行分泌性表达。里氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能。

2 里氏木霉产纤维素酶的诱导剂的研究

2.1材料与仪器

菌种：

里氏木霉Rut C-30：淮阴师范学院生命科学学院实验室保藏

原料：

马铃薯、琼脂、无菌水

预处理的秸秆、玉米浆购于淮安市百麦绿色生物能源有限公司

葡萄糖、硫酸铵、尿素、乳糖、低聚木糖、酒石酸钾钠、苯酚、偏重亚硫酸钠、柠檬酸购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR

3，5-二硝基水杨酸（DNS）购于国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP

硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁购于无锡市亚威化工有限公司，分析纯AR

磷酸二氢钾、氯化钴购于中国医药（集团）上海化学试剂公司，分析纯AR

硫酸锰购于上海试剂二厂，化学纯CP

氢氧化钠购于南京化学试剂有限公司，分析纯AR

仪器：

超净工作台：HDL APPARATUS

恒温振荡箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司

恒温培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司

台式低速离心机：Eppendorf centrifuge 5418

恒温水浴锅：上海精密实验设备有限公司

p H 计：上海精科

立式电热压力蒸汽灭菌器：日产

光栅分光光度计：上海元析仪器有限公司

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