大肠杆菌BL21菌株一步法感受态细胞制作及转化条件的优化

论文总字数：7620字

摘 要

质粒DNA 转化大肠杆菌是分子生物学研究领域中最常规的方法之一。一步法制备转化所需的感受态细胞及其相应的转化方法，操作方便，只加一种试剂即可, 且不需要另加保护剂就可直接冻存，更快捷稳定，转化时不需要热击。大肠杆菌BL21菌株是常用的异源表达宿主菌株，本论文旨在研究该菌株采用一步法制备感受态细胞及其转化的的可行性。结果表面，运用该方法，质粒pUC19、pET29a和pET29a-gfp均成功地实现了对菌株BL21的转化，转化效率达到了约10⁷每微克质粒DNA。

关 键 词：大肠杆菌BL21菌株，转化，一步法感受态

Abstract: Plasmid DNA into E. coli is one of the most conventional method of molecular biology research field. Step in the preparation of the cells and its corresponding transformation method, easy to operate, just add a reagent, don"t need to add protective agent can be cryopreserved directly, more fast and stable, don"t need to heat when the transformation E. coli BL21 strain is a common heterologous expression host strain, the paper aims to study the strain using step prepared cells and the feasibility of transformation. The results showed that plasmids pUC19、pET29a and pET29a-gfp were successfully transformed into strain BL21 using this method, transformation efficiency reached about one million transformants of plasmid DNA.

Keywords：E. coli BL21 strain, Transformation, One-step competent cells

目 录

1 前言 3

1 材料与方法 3

1.1供试菌株和质粒 3

1.2试剂和溶液 4

1.3 培养基 4

1.4 实验方法 5

1.4.1大肠杆菌BL21菌株一步法感受态细胞的制备 5

1.4.2大肠杆菌BL21菌株一步法感受态细胞的转化 5

1.5大肠杆菌质粒DNA的提取与电泳检测 5

1.5.1 质粒提取 5

1.5.2 质粒的琼脂糖凝胶电泳检测 6

2.结果与分析 6

2.1 大肠杆菌BL21菌株感受态细胞制备 6

2.2 待转化质粒的提取 7

2.3一步法感受态细胞转化 8

结 论 9

参考文献 10

致 谢 11

1 前言

在目前的生命科学研究领域，分子生物学实验技术高度发展，并被广泛应用，在此过程中，质粒DNA 转化大肠杆菌是该领域研究中最常规的方法之一。体外重组载体质粒分子必须导入适当的受体细胞中进行繁殖，才能获得大量的阳性重组子克隆及目的基因产物^[1]。质粒转化的方法主要有化学转化法^[2,3] 和电转化法^[4]。电转化法转化效率高, 转化的重组质粒也比较大，但要求一套特殊的仪器。大肠杆菌化学转化法的感受态细胞也有几种制备方法，其中最常用的化学法是用CaCl₂处理, 使之成为感受态细胞, 即CaCl₂法。该方法适用于大多数大肠杆菌菌株，由于该方法迅速且重复性好，能获得较好的转化效率，目前被广泛应用。此外，大肠杆菌感受态化学制备方法还有甘油-聚乙二醇法，氯化铷法^[5]和一步制备法^[6,7]。

CaCl₂法是用冰预冷的CaCl₂或多种2价阳离子等处理细菌, 使之进入感受态得以转化外源DNA。Ca² 的作用主要是破坏细胞膜上的脂质阵列 , 并与膜上多聚羟基丁酸、多聚无机磷酸形成复合物，以利于外源DNA 的渗入, 42℃热击能促使细胞吸收外源DNA。CaCl₂法不需要特殊的仪器设备, 操作简便,且重复性好, 能满足常规的基因克隆需要^[8]。 但CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞过程耗时长，操作要求较高，冰预冷的CaCl₂溶液重悬细胞时必须很轻柔谨慎和小心，感受态细胞的转化效率容易受到影响。

与CaCl₂法相比较，一步制备法的优点是，操作方便，只加一种试剂即可, 且不需要另加保护剂就可直接冻存，更快捷稳定，转化时，该法也更方便，此法转化时不需要热激。但一步法对实验操作要求所用器具一定要清洁，制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作，该方法的转化效率也相对较低，适用于对转化率要求不高的实验。

大肠杆菌由于遗传背景清楚,容易培养, 克隆载体与表达载体种类繁多,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统^[9]。大肠杆菌BL21 (DE3)菌株是目前最常用的外源基因异源重组表达宿主菌株，其表达载体的构建往往先在DH5a菌株中进行，表达载体构建成功以后再提取质粒转化BL21菌株，并进一步诱导外源基因表达。由于该过程中直接提取构建好的重组质粒转化BL21感受态细胞，因而对感受态细胞的转化效率要求不高，可以采用简单方便的一步法完成。本文正是基于此，探讨大肠杆菌BL21菌株的一步法感受态细胞的制备和转化的可行性。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和质粒

大肠杆菌BL21（DE3）菌株，用于制备感受态细胞；

pET29a，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，卡那霉素（KM）抗性；

pET29a-gfp，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，卡那霉素（KM）抗性；

pUC19，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，氨苄（AMP）抗性；

pNW33N，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，氯霉素（CM）抗性；

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