GASBD(s)蛋白的表达、纯化与淀粉亲和性分析

论文总字数：11184字

摘 要

：对重组蛋白GASBD(s) 在大肠杆菌BL21 (DE3) 中的表达水平进行了SDS–PAGE分析，结果表明与未诱导的对照相比，四个重组蛋白都表达了。通过Ni² –NTA亲和层析的方法对蛋白可溶性表达部分进行了纯化。将GASBD(s) 蛋白与不溶性淀粉结合进行定性分析，结果显示GASBD(s) 蛋白展现出很强的淀粉结合特性，同时还发现，GASBD(s) 蛋白与不溶性淀粉结合力随着融合蛋白中SBD串联重复数的增加而增强。

关键词：重组蛋白，表达，纯化，淀粉亲和性

Abstract：The expression level of recombinant protein GASBD (s) in Escherichia coli BL21 (DE3) was analyzed by SDS- PAGE, the results show that compared with the control without induction, four recombinant proteins are expressed. The soluble part of protein expression were purified by Ni² –NTA affinity chromatography. The GASBD(s) protein combined with insoluble starch were qualitatively analyzed, the results show that GASBD(s) protein have a strong starch binding characteristics. It is also found that, the affinity of GASBD(s) protein binding to insoluble starch was enhanced with increasing numbers of GASBD in the fusion proteins.

Keywords：recombinant proteins，expression，purification，the affinity of binding to starch

目 录

1 前言 4

2 实验材料 5

2.1 菌株 5

2.2仪器 5

2.3试剂 5

2.4 培养基 5

3 实验方法 5

3.1 重组蛋白的诱导表达与分析 5

3.2 重组蛋白的纯化 6

3.3 SDS-PAGE凝胶电泳 6

3.4 GASBD(s)蛋白与不溶性淀粉结合的定性分析 7

4 实验结果 7

4.1 重组蛋白的诱导表达与分析 7

4.2 重组蛋白GASBD(s)的纯化 8

4.3 GASBD(s)蛋白与不溶性淀粉结合的定性分析 10

结论 11

参 考 文 献 12

致 谢 13

1 前言

包括糖基转移酶类、糖苷水解酶类、多糖裂解酶类和糖酯酶类的碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes, CAZy) 是一大类很重要的酶，能够降解、修饰以及生成糖苷键。碳水化合物活性酶一般都是多结构域酶，通常是由两个或两个以上不同的结构域组成的。碳水化合物活性酶含有催化结构域和功能各不相同的其它结构域。其中碳水化合物结合结构域(Carbohydrate-Binding Module, CBM)是碳水化合物活性酶中最常见、也是最重要的结构域。到目前为止，已发现69种CBM，分别被命名为CBM1，CBM2，…， CBM69^[1]。在目前发现的69种CBM家族中，因为有些CBM家族具有与生淀粉结合的特性，所以这些结构域又被称为淀粉结合结构域(starch-binding domain, SBD)。

首先被确定的是黑曲霉糖苷酶的SBD结构，所以被认为是SBD结构的代表。淀粉结合结构域含有8个β折叠链，并且折叠链形成了两个主要的β折叠片。第一个β折叠片含有5条反平行的链，而第二个β折叠片则是由1条平行链和1对反平行的链组成的，C-末端和N-末端位于分子长轴的两端。这种排列形成了一种开放弯曲的β-桶状结构，N-末端与第7、第8条链形成环通过二硫键相连^[2]。在各种不同的酶中SBD的结合位点是各不相同的。环状芽抱杆菌CGTase SBD和黑曲霉糖化酶SBD具有可以同时结合两分子的底物两个糖基结合位点。通过NMR研究发现，结合有β-环糊精（一个环状淀粉类似物）的黑曲霉糖化酶SBD的结构在位于SBD的两端有两个独立的结合位点，每一个位点都具有两个或三个裸露的芳香族氨基酸。这两个结合位点在结构和功能上都是不同的^[3]。

SBD最根本的功能就是能与生淀粉结合^[3,4]。具体点来说，在完整的淀粉酶中，SBD具有三个不同的作用：SBD可以促使酶与不溶性底物在溶液中相互作用；将底物带到酶的催化区域(CD)的活性位点中；在某些特定情况下，它还可以破坏淀粉粒的表面结构^[5]。SBD主要应用于生物活性蛋白的分离纯化，这对于工业和科研领域而言具有重大意义，例如，Dalmia等^[6]在大肠杆菌中进行β-半乳糖苷酶-SBD融合蛋白的表达纯化研究；所谓SBD转基因平台技术就是将不具备淀粉亲和性或与淀粉亲和性低的一些具有特殊作用的外源酶蛋白的编码序列与SBD基因序列相连，再利用转基因技术将含有SBD的融合基因转到作物体内，例如，Ji等^[7]就将环状芽孢杆菌环状糊精糖基转移酶（CGTase）SBD的编码序列与马铃薯GBSSI信号肽序列融合在一起，在马铃薯GBSSI启动子的控制下，使SBD在无直链淀粉的马铃薯突变体(amf)的块茎中表达；SBD还能够控制淀粉颗粒的大小，在工业中，天然的和经化学修饰的淀粉粒是最有用的生物大分子；SBD还能应用于益生菌食品领域，通过SBD技术可以获得黏着性不同的淀粉，这在食品、纺织领域应用广泛。

本实验对重组蛋白GASBD(s) 在大肠杆菌BL21 (DE3) 中的表达水平进行了SDS–PAGE分析，并通过Ni² –NTA亲和层析的方法对蛋白可溶性表达部分进行了纯化。然后对纯化的GASBD(s) 蛋白与不溶性淀粉结合进行定性分析。

2 实验材料

2.1 菌株

含有质粒pET28a-GASBD(s)的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

2.2 仪器

台式冷冻恒温振荡箱，电磁炉，分光光度计，高压蒸汽灭菌锅，垂直板电泳槽及配套的玻璃板，电热恒温鼓风干燥箱，磁力加热搅拌器，pH计，超净工作台，恒温恒压电泳仪，脱色摇床，电子天平，通风柜，凝胶成像仪等。

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