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摘 要

以pTrcHisB-GASBD2质粒DNA为模板，扩增出BglII-Linker-GASBD-BamHI片段，然后将此片段插入到pTrcHisB-GASBD2质粒的BglII酶切位点中，即得到重组质粒pTrcHisB-GASBD3。pTrcHisB-GASBD4质粒的构建采用相同的方法进行。用BamHI酶和HindIII酶分别双酶切pTrcHisB-GASBD3和pTrcHisB-GASBD4重组质粒，并将BamHI-HindIII GASBDs小片段插入到pET28a质粒的对应酶切位点中，即得到重组质粒pET28a-GASBD3和 pET28a-GASBD4。

关键词：GASBD，载体构建，pET28a-GASBD3，pET28a-GASBD4

Abstract: The BglII-Linker-GASBD-BamHI fragments was amplified by PCR using pTrcHisB-GASBD2 plasmid DNA as a template, and then inserted into cloning vector pTrcHisB-GASBD2 plasmid to generate recombinant plasmid pTrcHisB-GASBD3. pTrcHisB- GASBD4 plasmid was constructed using the same method. The BamHI-HindIII-GASBDs fragments of pTrcHisB-GASBD3 and pTrcHisB-GASBD4 were, respectively, inserted into the corresponding restriction sites of pET28a plasmid to get two recombinant plasmids pET28a-GASBD3 and pET28a-GASBD4.

Keywords：GASBD ，vector construction，pET28a-GASBD3，pET28a-GASBD4

目 录

1前言 4

2 实验材料 5

2.1 菌株与质粒 5

2.2主要购买试剂 5

2.3主要仪器设备 5

2.4自制试剂 5

3 实验方法 5

3.1 pTrcHisB-GASBD3质粒的构建 5

3.1.1 pTrcHisB-GASBD2 DNA质粒的提取 5

3.1.2 BglII- Linker –GASBD-BamHI片段的扩增 6

3.1.3 PCR产物的纯化、酶切与回收 6

3.1.4 pTrcHisB-GASBD2质粒的DNA单酶切 6

3.1.5 重组质粒pTrcHisB-GASBD3的构建 7

3.1.6 阳性克隆的筛选和鉴定 7

3.2 pTrcHisB-GASBD4质粒的构建 8

3.3 pET28a-GASBD3和 pET28a-GASBD4质粒的构建 8

4 结果与分析 8

4.1 pTrcHisB-GASBD3质粒的构建 8

4.2 pTrcHisB-GASBD4质粒的构建 9

4.3 pET28a-GASBD3和pET28a-GASBD4质粒的构建 10

结 论 12

参 考 文 献 13

致 谢 14

1前言

一些具有多结构域的微生物淀粉酶具有生淀粉结合能力，其中的一个结构域称为淀粉结合结构域(starch-binding domain, SBD) ^[1]，它的功能是加速淀粉酶与淀粉粒表面结合能力，增加淀粉粒表面酶的浓度，从而可以加速淀粉粒的水解速度^[2]。到2014年为止,具有这些功能的家族有：CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、CBM41、CBM45、CBM48、CBM53、CBM58和CBM69,其中CBM69是2014才被确立的新家族。

CBM20家族SBD的氨基酸是100个左右并且具有很好的保守性。黑曲霉糖化酶SBD（属于CBM20家族）的三维结构是第一个被确定的，是SBD结构的代表。在此结构域中含有8条β链，而且形成了两个重要的β折叠片^[3]。其中5条反向平行的β链组成了第一个β折叠片，而由1条平行β链和1对反向平行β链组成第二个β折叠片。由于C-末端和N-末端分别位于SBD分子长轴两端，所以形成了一种开放、扭曲的β-折叠桶结构，并在N-末端与第7、第8两条链形成的环之间形成了一个二硫键^[3]。在黑曲霉糖化酶SBD的结构上，可以明显的发现有两个独立的结合位点，分别存在于SBD的两端，每一个位点上面都会存在着两个或三个裸露的芳香族氨基酸，不过这两个结合位点在结构和功能上还是有很大差异的^[4]。结合位点1易于接近且比较小，它主要对淀粉识别和结合起到明显的作用，同时可以使结合位点2的结构发生改变，使其更加稳定的与淀粉的第二条链相结合。结合位点2则与1不同，显得较大，不过结合位点2更具有延伸性和灵敏性。

完整淀粉酶的SBD有三个作用：（1）可以使溶液中的酶与不溶性底物进行相互作用；（2）将底物运输到酶催化区域(CD)的活性位点；（3）特殊条件下它能使淀粉粒表面结构破坏^[4]。有证据表明，SBD不管是整合到其它酶或是蛋白质里，都具有独立性且具有生淀粉结合功能 ^[5]。还有实验证明，没有与生淀粉粒具有结合能力的酶在与SBD的融合而可以与淀粉粒结合^[5,6]。利用这些特点，SBD在生物技术中有以下几点的应用：（1）分离纯化生物活性蛋白。因为SBD的独立性和功能特性，而且淀粉有优良的物理性质和价格低廉的优势。（2）改良淀粉酶的理化性质。Chen等^[7]利用黑曲霉糖化酶SBD与半乳糖苷酶融合从而增强了半乳糖苷酶与生淀粉结合能力。（3）SBD转基因平台技术。将一些淀粉亲和性低或没有的外源酶蛋白的基因序列与SBD结合，利用转基因技术可以把SBD融合蛋白转到作物中，在这过程中改变了淀粉生物合成途径、改变淀粉分子结构, SBD技术为淀粉成为蛋白的携带体成为可能。（4）益生菌食品领域。SBD技术已经可以产生出粘着性完全不相同的淀粉。

本实验以pTrcHisB-GASBD2质粒为基础，构建了两个原核表达载体pET28a-GASBD3和 pET28a-GASBD4。

2 实验材料

2.1 菌株与质粒

大肠杆菌(Esherichia coli) DH5α菌株、pET28a质粒和 pTrcHisB-GASBD2质粒本实验室保存。

2.2主要购买试剂

Pfu DNA Polymerase、DNA markerIII购自南京天为生物公司；各种限制性内切酶购于大连宝生物公司；T4快速连接酶购自于MBI公司；DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自上海生工；其他化学试剂均为分析纯。

2.3主要仪器设备

PCR仪(Eppendorf)、高速冷冻离心机(Eppendorf), 凝胶成像系统(BIO-RAD )、超净工作台(苏州净化设备厂)、制冰机和超低温冰箱(SANYO )、台式冷冻离心机(Eppendorf)、培养箱、DYYIII型电泳仪和琼脂糖水平电泳槽(北京六一)、各种型号移液器、Eppendorf管若干、平板若干。

2.4自制试剂

TE ( pH=8.0)缓冲液、LB培养基(培养大肠杆菌用)、氨苄青霉素(Amp )、卡那霉素、苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：l)、质粒提取溶剂I、质粒提取溶剂II、质粒提取溶剂III、30%甘油、CaCl₂（0.1mol/L）。

3 实验方法

3.1 pTrcHisB-GASBD3质粒的构建

3.1.1 pTrcHisB-GASBD2质粒DNA的提取

(1) 将含有pTrcHisB-GASBD2质粒的大肠杆菌菌种接种到含50μg/mL Amp 的LB平板上，37℃的条件下过夜培养14h；挑取平板上活化的单菌落接种到15ml含50μg/mL Amp LB液体培养基中，37℃下振荡培养约14h。

(2) 取1.5ml 培养物倒入Eppendorf管中，8000r/min离心1min，去除掉上清液，将离心管倒置在滤纸上数分钟。

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