论文总字数：13712字

摘 要

关键词：β-葡萄糖苷酶，黑曲霉，DES诱变

Abstract：β-Glucosidase is one of the components of cellulase, which is important in cellulose -degrading. In this paper, screening of the Aspergillus niger with the high production enzyme of the β-glucosidase by DES mutagenesis was studied. Results were as followed: 1) Aspergillus niger 3.316 was selected as the parent strain, death curve is obtained by DES mutagenesis, and the beast mutagenesis time was 30~40 minutes; 2）obtained 48 mutants by plants screening according diameter of transparent zone; 3）the enzyme activity of the mutants enhanced smaller proportion; 4）activity of the mutant DES-43 was 21±0.34 U/mL, and the relative enzyme activity was 11±0.54 U/µg. This thesis provides excellent strains to cellulose ethanol production.

Keywords: β-Glucosidase, Aspergillus niger, Mutation by diethyl sulfate

目录

1 引言 5

1.1 β-葡萄糖苷酶在日常生活中的应用 5

1.2 常规诱变育种技术在选育β-葡萄糖苷酶高产菌株中的研究进展 6

1.3 β-葡萄糖苷酶的发酵生产概况 6

1.4 实验思路设计 7

2 材料与方法 8

2.1 材料 8

2.1.1 菌株 8

2.1.2 培养基 8

2.1.3 主要试剂 8

2.1.4 仪器设备 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 PDA培养基的制备 9

2.2.2 黑曲霉菌株的制备 9

2.2.3 DES诱变 9

2.2.4 致死曲线 9

2.2.5 诱变菌株初筛 10

2.2.6 诱变菌株复筛 10

2.2.7 标准葡萄糖苷酶酶活计算 10

2.2.8 蛋白质测定方法—Bradford法 11

3 结果分析 12

3.1致死曲线 13

3.2初筛 13

3.3复筛 14

3.3.1 诱变菌株酶活 14

3.3.2 蛋白含量 15

3.4 诱变菌株的比酶活 16

3.5遗传稳定性 17

4 结论与展望 18

4.1 结论 18

4.2 展望 18

参考文献 20

致谢 21

1 引言

1.1 β-葡萄糖苷酶在日常生活中的应用

随着不可再生的化石能源日渐枯竭，越来越多的科学研究都集中到了新能源的开发和利用上，其中生物质能由于其来源丰富，成本低廉和可再生性而备受人们的青睐。纤维素作为地球上最丰富的可再生资源之一，可以为生物质能提供丰富的来源^[1]。全球每年光合作用产生的纤维素总量可达10¹¹ t，但是，由于纤维素分子是由葡萄糖分子以1, 4-糖苷键结合而成的线状高分子聚合物，所以难以被直接利用，必须降解成小分子糖类物质后才可被加以利用。而β-葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖和短链的纤维寡糖，将纤维二糖水解成葡萄糖，从而去除其对纤维素酶的抑制作用，有效地提高纤维素的降解效率。除了在纤维素降解中的应用之外，β-葡萄糖苷酶还有其它多种用途。例如：在果汁行业中，人们就利用β-葡萄糖苷酶对糖苷键的作用来增加果汁的香气^[2]；在食品行业中，人们利用它可以降解某些生氰物质，达到脱除食品加工原料的毒性的目的^[3]。

β-葡萄糖苷酶，它是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键，释放葡萄糖的酶^[2]，广泛的存在于自然界的各种微生物中，包括细菌、放线菌、丝状真菌等，并且在一些动植物体内也有少量分布(见表1)。

表1产β-葡萄糖营酶的生物种类

在微生物来源方面，对β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、细菌、霉菌等,而其中要数对曲霉、康氏木霉的研究最多。目前主要用黑曲霉(Aspergillus niger)发酵培养来获得β-葡萄糖苷酶。虽然β-葡萄糖苷酶在各类微生物中普遍存在，但是，野生型的菌株产酶活力较低，因此对高产β-葡萄糖苷酶菌株进行选育就显得十分有必要。

1.2 常规诱变育种技术在选育β-葡萄糖苷酶高产菌株中的研究进展

目前，关于产β-葡萄糖苷酶菌株的选育工作大多数是利用传统的诱变技术，该技术具有三大显著的优点，分别是速度快、收效大、方法简单。而菌株选育的方法一般包括非定向诱变和定向诱变^[4]。非定向诱变是随机的，通过物理、化学的诱变因子使微生物的遗传物质发生随机突变，通过简单有效的筛选方式获得所需要的目的菌株。常用的物理诱变剂包括紫外线^[5]、γ射线等，常用的化学诱变剂有硫酸二乙酯(DES)^[6]、甲基磺酸乙酯(EMS)^[7]等。非定向诱变育种技术包括传统的理化性质诱变、原生质体的诱变和原生质体融合等。通常是直接利用外源的诱变因子来进行菌株处理，使菌株的遗传物质发生一定的改变。采用非定向的方法进行诱变育种时，往往不需要彻底清楚地了解微生物的代谢途径和机制。而与之相反的是，定向诱变育种首先就应该了解清楚目标产物在微生物体内的合成机制，一般包括如下的程序^[8]： (1)选择合适的酶 (2)根据目标产物的结构确定氨基酸序列 (3)确定突变的位点。定向诱变中基因工程菌株的构建就是将β-葡萄糖苷酶的表达基因转入到宿主菌株，并使其分泌。

而在常规诱变育种选育高产菌株时，最关键步骤的就是筛选平板的选择。选择有效合适的筛选平板可以极大的减少后期的筛选工作量。筛选平板是利用待筛选的菌株对平板中的底物降解能力的高低或发生其它化学反应产生的颜色变化或出现水解圈来达到筛选的目的。透明圈筛选法是根据平板透明圈直径与菌落直径的比值大小从而来判断菌株的水解能力。目前已报道的筛选平板包括七叶苷平板和β-葡聚糖刚果红营养平板法^[9]。在诱变选育高产β-葡萄糖苷酶产酶菌株的研究中，大多数都是以黑曲霉为出发菌株，因为它与其他的菌株相比，具有较强的β-葡萄糖苷酶的分泌能力而且是被公认的安全生产菌株。任大明^[10]等以黑曲霉为出发菌株，通过紫外线（UV）、硫酸二乙酯(DES) 和Co⁶⁰进行复合诱变，使得诱变后菌株的产β-葡萄糖苷酶活性比出发菌株显著提高，3种处理方法分别提高了36%、28%和32%。王景林^[11]等人对一种突变型黑曲霉M001分别经紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)、TDP辐射仪及空间微重力辐射(SC)等多重诱变因素的多级循环处理，最终得到1株形态发生改变的变异菌株X215。将上述的变异菌株X215以固体培养的方式培养，最终发现其β-葡萄糖苷酶活力提高比较明显，为154 U/g，是出发菌株M001的4.1倍。

1.3 β-葡萄糖苷酶的发酵生产概况

在产酶的过程中，发酵培养基是仅次于菌株选择的关键因素，因此，对发酵培养基进行优化可有效地提高目标产物的产率。培养基优化方面主要包括碳源、氮源、无机盐、微量元素等条件的选择，发酵技术的优化包括菌种的接种、培养温度、溶氧等发酵参数的控制。

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