论文总字数：12978字
摘 要
黄瓜枯萎病是黄瓜栽培过程中经常发生的一种土传性病害，给农业生产造成了严重损失。近年来，利用生物方法防治黄瓜枯萎病取得了较大进展，并呈现多样化的发展趋势，已成为防治该病害的重要且有效手段。本文通过瓜菇轮作模式中黄瓜根围土壤样品采集，菌株分离，体外酶活检测以及平板拮抗实验来筛选能够防治黄瓜枯萎病的生防菌株。研究结果表明在172株菌株中，具有几丁质酶活性的有51株；具有嗜铁素酶活性的有59株；具有产IAA活性的有25株；具有ACC脱氨酶活性的有86株，且172株菌株都有纤维素酶活性。另外，在172株菌株中具有黄瓜枯萎病菌拮抗作用的菌株只有9株。本研究目的是为生产中黄瓜枯萎病的防治奠定基础。关键字：黄瓜枯萎病；生物防治；拮抗细菌
Abstract: Fusarium wilt is a common disease on cucumber (Cucumis sativus L.), which has brought severe loss to agriculture production. In recent years, great progess has been made in controlling this disease by biological control method and a diversified development trend is presented.Bio-control has become an important and effective mean against Fusarium wilt in cucumber. Based rotation model of melon mushroom in cucumber rhizosphere soil samples, strains in vitro enzyme activity checks and antagonistic effect of plate experiments to filter to control cucumber wilt disease biocontrol strains. The results show that 172 strains, with chitinase activity of 51 strains had; with siderophore enzyme activity of 59 strains; with the activity of IAA production of 25 strains; with ACC deaminase activity has 86 strains and 172 strains have cellulase activity. In addition, with Fusarium oxysporum in antagonism of the 172 strains only 9 strains. Aimed at laying the foundations for production in the prevention and cure of cucumber Fusarium wilt.
Keywords: cucumber Fusarium wilt; biocontrol; antagonistic bacteria
目录
1.前言 4
2.材料与方法 5
2.1菌株分离 5
2.2培养基与试剂 5
2.3产酶和代谢产物活性测定 6
2.3.1几丁质酶活性检测 6
2.3.2产嗜铁素活性检测 6
2.3.3纤维素酶活性的检测 6
2.3.4产IAA细菌的定性测定 6
2.3.5产ACC脱氨酶活性菌株筛选 7
2．4平板拮抗实验 7
2.4.1拮抗菌的筛选 7
3.结果与分析 7
4.讨论 12
结论 14
参考文献 15
致谢 17
1.前言
黄瓜枯萎病（cucumber Fusarium wilt）又称萎蔫病、蔓割病、死秧病等，是一种具有世界性的毁灭性土传真菌病害，且在我国各地均有发生。黄瓜枯萎病的病原菌是尖孢镰刀黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen），病原菌从其根部伤口和根毛生长点侵入植株，进入破坏黄瓜植株的根茎和叶的维管束，使得其吸收和运输水分的功能丧失，最终将导致黄瓜植株的枯萎死亡[1,7]。枯萎病一般会造成黄瓜的产量下降10%～30%，但严重时可能会下降80%～90%，是黄瓜病害中最为严重且造成经济损失最大的病害之一。随着每年黄瓜种植面积的逐渐扩大，由此带来的损失更为严重。因此，深入研究有效防治黄瓜枯萎病的方法已成为当前生产中的重要问题[2,8]。
目前，药剂防治是控制黄瓜枯萎病的重要方法，但是由于缺乏高效、低毒、无污染的杀菌剂，故易造成农药的残留，危害人们身体健康[3]。另外，由于黄瓜枯萎病属于土传病害，难以实行大面积的土壤药剂处理，所以成本较高[4]。随着现代社会的发展，人们对无公害食品的强烈需求和环境保护的日益注重，生物防治引起了人们的高度重视[5]。
近年来，涉及黄瓜枯萎病生物防治的研究越来越多，并取得较大的进展，新开发出很多生防因子和生防制剂，各种生防因子的交互使用，使得黄瓜枯萎病的生物防治手段呈多样化发展，更便于人们因地和因时制宜的选择合理有效的防治方法[6]。简单来说，生物防治主要是利用拮抗微生物以及其代谢产物来达到防治植物病害的目的。筛选高效的拮抗微生物是生物防治的前提与关键。
黄瓜枯萎病是黄瓜生产中重要病害，严重影响黄瓜产量与品质，瓜菇轮作模式作为本地区特色农业种植方式，在该模式中，黄瓜枯萎病发病率显著降低。本研究以该模式作为研究对象，拟从菇渣处理后的黄瓜根围土中分离能够防治黄瓜枯萎病的生物防治菌株并且进行初步评价。首先通过离体条件下产酶活性筛选具有生防潜力的菌株，然后进行温室实验评价。旨在寻找一条适合本地区特色栽培方式的黄瓜枯萎病防治方法。
2.材料与方法
2.1菌株分离
从江苏省淮安市淮阴区丁集黄瓜大棚里采集根际土壤，用自封袋封好后带回实验室，然后称取根围土3 g, 分别加入到 27 mL 灭菌水中（含灭菌玻璃珠），180 rmp 摇床振荡 0.5 h，静置 5 min，得到10-1 稀释液，吸取上清液 0.1 mL 依次稀释，分别取 10-4---10-6 三个梯度 0.1 mL 涂 LB 平板，28°C 培养 48 h,选取菌落数在 50---300 之间的平板，计数并且挑取所有菌落，纯化，-70℃，40 % 甘油保存备用[9]。共纯化菌株172株待实验，标记为T1-1~T1-28；T2-1~T2-16；T3-1~T3-12及T3-30；C1-1~C1-52；C2-1~C2-25；C3-1~C3-39。
2.2培养基与试剂
LB培养基(1L)：氯化钠 10 g，胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，琼脂 20g。PH值调至7.2。PDA培养基（1L）：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖（或蔗糖）20.0g，琼脂15-20g。自然pH。制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热融化后再补足水分至1000ml，121℃下灭菌20分钟左右。
2.3产酶和代谢产物活性测定
2.3.1几丁质酶活性检测
将细菌在以几丁质为唯一碳源的培养基（Chi-Ayers）：（NH4H2PO4 1.0g,KCl 0.2g, MgSO4·7H2O 0.2g，胶体状几丁质1%（w/v），定容至1000ml，pH=7.0，琼脂20g）上培养，接菌后30℃培养3天，测透明圈的内径和外径。
胶体状几丁质的制备：20 g 甲壳素溶于 350 mL 浓盐酸，4 ℃放置 24 h，玻璃棉过滤，滤液加入 2 L 冰无水乙醇(－20 ℃过夜)，10000 g离心20 min，沉淀用自来水冲洗，直至 pH 为中性，冷冻干燥，－20 ℃密封保存。使用时，胶体状几丁质必须用手动匀浆器至少研磨 5 次 [10]。
2.3.2产嗜铁素活性检测
测定嗜铁素是否产生，参照 Shin 等人[11]的方法。A：1，60.5 mg CAS (铬天青S) 溶于 50 mL 去离子水；2，10 mL三价铁溶液(1 mM FeCl3.6H2O，10 mM 盐酸为溶剂)；3，72.9 mg HDTMA 溶于 40 mL去离子水。上述三个溶液混合定容至 100 mL，pH调至中性，121℃灭菌 20 min。B：30.24 g Pipes加入 900 mL Waker agar培养基，12 g 50% (W/V) 的 NaOH 溶液将培养基 pH 调至 6.8，121℃灭菌 20 min。A，B液混合倒平板，接菌 30℃ 培养 3 天观察并且测量透明圈内径和外径。
2.3.3纤维素酶活性的检测
纤维素酶活性测定参照[12] 方法。把准备好的菌株接到纤维素酶活性测定平板(蛋白胨 10 g，酵母粉 10 g，羧甲基纤维素钠 10 g，氯化钠 5 g，磷酸二氢钾 1 g，琼脂 18 g，定容至 1000 mL， pH=7.0)，30℃培养 48 h后，用 1 g/L的刚果红染 1 h 后，倒掉染液后，用1 M的 NaCl 浸泡 1 h。检测透明圈的有无并且测量其内径和外径。
2.3.4产IAA细菌的定性测定
将分离纯化后的细菌接种于含有L色氨酸（100mg/L）的LB液体培养基中，30℃，180r/min条件下摇床培养1天。取50ul菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50uLSalkowski比色液（50ml35%的HClO4 1ml0.5mol/LFeCl3）。白色陶瓷板于室温，避光条件下放置30min后观察，颜色变红者表示能产生IAA。
2.3.5产ACC脱氨酶活性菌株筛选
DF盐培养基：磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二钠6g/L，七水硫酸镁0.2g/L，葡萄糖2g，柠檬酸2g，pH7.2加富培养基（DFa）。ACC溶于超纯水后抽滤灭菌，加到预先灭菌的DF盐培养基中，ACC终浓度为3mmol/L，将微生物接种到Dfa培养液中，能生长的代表能够产生ACC脱氨酶。
2．4平板拮抗实验
2.4.1拮抗菌的筛选
黄瓜枯萎病病原菌在PDA平板上28℃下培养7天左右，用直径5mm的打孔器在平板上打孔取圆形琼脂块。将直径为5mm的 黄瓜枯萎病病原菌菌饼接入PDA平板中央，28℃培养2天，然后，用灭菌牙签在病原菌菌饼周围等距离处点接种待测的拮抗细菌，于培养箱中28℃培养5天后观察记录抑菌圈的有无及抑菌圈直径，选出有抑菌圈的菌株[13-16]。
3.结果与分析
表1菌株5种产酶和代谢产物活性检测结果
菌号 | 纤维素酶活 | 几丁质酶活 | 嗜铁素酶活 | 产IAA活性 | ACC脱氨酶活性 |
T1-1 | 0.22 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T1-2 | 0.23 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T1-3 | 0.23 | 0.00 | 0.00 |
| 0 |
T1-4 | 0.60 | 0.00 | 0.17 | 0 | 0 |
T1-5 | 0.27 | 0.02 | 0.02 |
|
|
T1-6 | 0.77 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T1-7 | 0.43 | 0.15 | 0.00 | 0 |
|
T1-8 | 0.45 | 0.10 | 0.00 | 0 | 0 |
T1-9 | 0.15 | 0.50 | 0.00 | 0 |
|
T1-10 | 0.40 | 0.00 | 0.03 |
|
|
T1-11 | 0.28 | 0.12 | 0.00 | 0 |
|
T1-12 | 0.28 | 0.18 | 0.03 | 0 | 0 |
T1-13 | 0.77 | 0.07 | 0.03 | 0 |
|
T1-14 | 0.40 | 0.07 | 0.00 | 0 | 0 |
T1-15 | 0.33 | 0.00 | 0.03 |
|
|
T1-16 | 0.60 | 0.00 | 0.08 | 0 |
|
T1-17 | 0.33 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T1-18 | 0.62 | 0.07 | 0.15 | 0 |
|
T1-19 | 0.40 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T1-20 | 0.15 | 0.08 | 0.00 | 0 |
|
T1-21 | 0.65 | 0.07 | 0.13 | 0 |
|
T1-22 | 0.37 | 0.07 | 0.00 | 0 | 0 |
T1-23 | 0.80 | 0.00 | 0.02 | 0 |
|
T1-24 | 0.37 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T1-25 | 0.17 | 0.00 | 0.02 | 0 |
|
T1-26 | 1.03 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T1-27 | 0.07 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T1-28 | 0.13 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T2-1 | 0.67 | 0.00 | 0.22 | 0 | 0 |
T2-2 | 0.32 | 0.00 | 0.20 |
| 0 |
T2-3 | 0.77 | 0.00 | 0.12 | 0 |
|
T2-4 | 0.67 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T2-5 | 0.63 | 0.00 | 0.10 | 0 |
|
T2-6 | 0.68 | 0.00 | 0.15 | 0 | 0 |
T2-7 | 0.82 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T2-8 | 0.73 | 0.00 | 0.12 | 0 |
|
T2-9 | 0.37 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T2-10 | 0.35 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T2-11 | 0.70 | 0.00 | 0.10 | 0 | 0 |
T2-12 | 0.70 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T2-13 | 0.85 | 0.00 | 0.10 | 0 |
|
T2-14 | 0.58 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T2-15 | 0.67 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T2-16 | 0.13 | 0.00 | 0.03 |
| 0 |
T3-1 | 0.75 | 0.00 | 0.03 | 0 |
|
T3-2 | 0.30 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
T3-3 | 0.77 | 0.00 | 0.10 | 0 |
|
T3-4 | 0.75 | 0.00 | 0.03 | 0 | 0 |
T3-5 | 0.70 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T3-6 | 0.47 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T3-7 | 0.67 | 0.00 | 0.03 | 0 |
|
T3-8 | 0.90 | 0.00 | 0.05 | 0 | 0 |
T3-9 | 0.90 | 0.00 | 0.07 | 0 | 0 |
T3-10 | 0.67 | 0.00 | 0.32 | 0 |
|
T3-11 | 0.32 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T3-12 | 0.70 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
T3-30 | 0.06 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-1 | 0.35 | 0.00 | 0.05 |
| 0 |
C1-2 | 0.60 | 0.23 | 0.00 |
|
|
C1-3 | 0.22 | 0.00 | 0.03 |
|
|
C1-4 | 0.58 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-5 | 0.22 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-6 | 0.53 | 0.05 | 0.00 | 0 |
|
C1-7 | 0.48 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-8 | 0.27 | 0.00 | 0.17 | 0 | 0 |
C1-9 | 0.38 | 0.03 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-10 | 0.33 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-11 | 0.30 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-12 | 0.30 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-13 | 0.27 | 0.13 | 0.00 |
|
|
C1-14 | 0.12 | 0.00 | 0.00 |
| 0 |
C1-15 | 0.38 | 0.00 | 0.02 | 0 | 0 |
C1-16 | 0.20 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-17 | 0.20 | 0.12 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-18 | 0.35 | 0.00 | 0.30 | 0 | 0 |
C1-19 | 0.23 | 0.17 | 0.00 |
| 0 |
C1-20 | 0.42 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-21 | 0.37 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-22 | 0.23 | 0.03 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-23 | 0.65 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-24 | 0.35 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-25 | 0.43 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-26 | 0.40 | 0.03 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-27 | 0.95 | 0.02 | 0.00 | 0 |
|
C1-28 | 0.27 | 0.10 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-29 | 0.40 | 0.33 | 0.03 | 0 | 0 |
C1-30 | 0.23 | 0.22 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-31 | 0.32 | 0.13 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-32 | 0.60 | 0.05 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-33 | 0.38 | 0.03 | 0.00 |
|
|
C1-34 | 0.17 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-35 | 0.68 | 0.13 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-36 | 0.75 | 0.23 | 0.03 | 0 | 0 |
C1-37 | 0.25 | 0.10 | 0.00 |
| 0 |
C1-38 | 0.33 | 0.22 | 0.02 | 0 | 0 |
C1-39 | 0.50 | 0.07 | 0.10 | 0 | 0 |
C1-40 | 0.37 | 0.12 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-41 | 0.58 | 0.00 | 0.00 |
| 0 |
C1-42 | 0.58 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-43 | 0.25 | 0.03 | 0.08 |
| 0 |
C1-44 | 0.57 | 0.13 | 0.02 | 0 | 0 |
C1-45 | 0.28 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-46 | 0.35 | 0.00 | 0.13 | 0 | 0 |
C1-47 | 0.38 | 0.00 | 0.03 | 0 |
|
C1-48 | 0.32 | 0.17 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-49 | 0.15 | 0.00 | 0.17 | 0 |
|
C1-50 | 0.50 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C1-51 | 0.28 | 0.00 | 0.00 |
| 0 |
C1-52 | 0.13 | 0.03 | 0.00 | 0 | 0 |
C2-1 | 0.87 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C2-2 | 0.28 | 0.00 | 0.20 | 0 | 0 |
C2-3 | 0.35 | 0.00 | 0.00 |
|
|
C2-4 | 0.37 | 0.10 | 0.00 | 0 |
|
C2-5 | 0.23 | 0.40 | 0.00 |
| 0 |
C2-6 | 0.43 | 0.08 | 0.07 | 0 |
|
C2-7 | 0.68 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C2-8 | 0.43 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C2-9 | 0.18 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C2-10 | 0.37 | 0.00 | 0.00 |
|
|
C2-11 | 0.35 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C2-12 | 0.23 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C2-13 | 0.35 | 0.00 | 0.02 | 0 |
|
C2-14 | 0.52 | 0.00 | 0.15 | 0 | 0 |
C2-15 | 0.55 | 0.00 | 0.37 | 0 | 0 |
C2-16 | 0.60 | 0.00 | 0.00 |
| 0 |
C2-17 | 0.27 | 0.00 | 0.17 | 0 |
|
C2-18 | 0.28 | 0.10 | 0.10 | 0 | 0 |
C2-19 | 0.25 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C2-20 | 0.62 | 0.00 | 0.07 | 0 | 0 |
C2-21 | 0.62 | 0.00 | 0.02 | 0 | 0 |
C2-22 | 0.20 | 0.00 | 0.05 | 0 | 0 |
C2-23 | 0.13 | 0.15 | 0.10 | 0 | 0 |
C2-24 | 0.17 | 0.38 | 0.00 | 0 | 0 |
C2-25 | 0.20 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C3-1 | 0.68 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-2 | 0.63 | 0.00 | 0.03 | 0 |
|
C3-3 | 0.38 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C3-4 | 0.55 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-5 | 0.37 | 0.00 | 0.00 |
| 0 |
C3-6 | 0.13 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-7 | 0.38 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-8 | 0.27 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-9 | 0.30 | 0.00 | 0.13 |
| 0 |
C3-10 | 0.27 | 0.05 | 0.00 | 0 |
|
C3-11 | 0.35 | 0.07 | 0.03 | 0 |
|
C3-12 | 0.18 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-13 | 0.18 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-14 | 0.42 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-15 | 0.35 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-16 | 0.22 | 0.07 | 0.00 | 0 |
|
C3-17 | 0.25 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-18 | 0.37 | 0.00 | 0.00 |
|
|
C3-19 | 0.45 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-20 | 0.25 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-21 | 0.38 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-22 | 0.43 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-23 | 0.28 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-24 | 0.50 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-25 | 0.65 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-26 | 0.03 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-27 | 0.37 | 0.00 | 0.15 | 0 | 0 |
C3-28 | 1.02 | 0.03 | 0.28 |
|
|
C3-29 | 0.42 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-30 | 0.33 | 0.00 | 0.10 | 0 |
|
C3-31 | 0.47 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C3-32 | 0.28 | 0.00 | 0.00 | 0 |
|
C3-33 | 0.58 | 0.03 | 0.00 | 0 |
|
C3-34 | 0.67 | 0.07 | 0.00 | 0 |
|
C3-35 | 0.35 | 0.03 | 0.03 | 0 |
|
C3-36 | 0.30 | 0.03 | 0.00 | 0 |
|
C3-37 | 0.15 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C3-38 | 0.23 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
C3-39 | 0.40 | 0.00 | 0.00 | 0 | 0 |
注：数据代表水解圈半径，为3次重复实验平均值，单位为cm。
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