论文总字数：6765字
摘 要
以青虾的腮，肝胰脏，肌肉为材料，采用改进的空气干燥法制备染色体 ，对青虾进行细胞遗传学研究，主要研究了青虾的染色体数目。结果表明，对20个青虾中60个良好的中期分裂相进行染色体计数，染色体数目为88的出现频率最高，达到了61.7%，从而明确青虾的二倍体染色体数目为88，即2n=88。
关键词：青虾；染色体；数目；核型
Abstract：The cytogenetic study was conducted in Macrobrachium nipponense by preparation of chromosome spreads from gills, hepatopancreas, muscle using modified air-dry method, focussing on the chromosome numbers of Macrobrachium nipponense. the results showed that there are 88 chromosome in diploid(2n=88) based on the maximal frequency of 88 in chromosome number, that is, accounting for 61.7% in 60 metaphase chromosomes of 20 Macrobrachium nipponenses.
Keywords：,Macrobrachium nipponense, chromosome, number,karyotype
目录
1 前言 6
2 材料与方法 7
2.1 材料 7
2.1.1 青虾 7
2.1.2 试剂 7
2.1.3 试剂配制 7
2.1.4 仪器与器具 7
2.2 方法 7
2.2.1 注射秋水仙素 7
2.2.2 解剖取组织 8
2.2.3 低渗 8
2.2.4 固定 8
2.2.5 解离与制片（压片与滴片） 8
2.2.6 染色 8
2.2.7 观察 9
3 结果与分析 9
3.1最佳条件的选定 9
3.1.1最适低渗浓度的选择 9
3.1.2最佳低渗时间的选择 9
3.1.3最佳制片方法的选择 10
3.2青虾染色体数目的确定 10
4. 结论 13
致 谢 15
1 前言
青虾，又称河虾，学名为日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，隶属于节肢动物门（Arthropoda),甲壳纲（Crustacea），十足目（Decapoda），长臂虾科（Palamonidae），沼虾属（Macrobrachium），广泛分布于我国江河、湖泊、水库和池塘中，是优质的淡水虾类。江苏省是我国日本沼虾分布较广且利用高的主要省份之一[1]，其中长江中下游地区最为丰富，如洞庭湖，太湖等地，另外江苏的洪泽湖，河北白洋淀等地也有较大野生资源量[2]。青虾肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，是高蛋白低脂肪的水产食品，颇得消费者青睐。
目前国内对青虾的研究主要集中在混养技术、急性毒性试验、以及盐度和中草药等
对其存活和生长的影响研究。近年来，青虾的产量和市场需求不断增加，为了更好的进行
人工养殖，育种和选种，水产经济动物遗传育种研究也自然而然进入高速发展阶段，染色
体讨论作为基础理论越来越显示出它的关键性和急切性，染色体制备技术的要求也越来越
高。十足类甲壳动物染色体的研究至今有一百多年的历史，但是却仍未获得很大的发展，
Carnoy 首次报道了褐虾和滨蟹[3]的染色体， 到目前为止已研究过的种类仅约70 多种[4-8]。
主要原因是由于其细胞有丝分裂中期染色体形状太小，不超过4微米，而且数目庞大， 染
色体标本制备和分析都非常困难，仍然仅限于统计染色体数目的水平。王青等[9]先后对
十足目甲壳动物共计27科96种进行了染色体数目的研究，其中对3科20种进行了核型
分析；姜叶琴等[10]对太湖秀丽白虾进行了染色体和核型的研究；邱高峰等[11]用低渗法对精
巢标本的染色体进行过研究，但对胚胎材料的染色体制备与核型分组未做研究。
本文通过低渗，固定，改进的空气干燥法来制备青虾的染色体，对青虾进行染色体的初步研究，即对青虾染色体数目进行确定。
2 材料与方法
2.1 材料
原材料所用的青虾取自学校附近的水产市场。买回来的青虾立刻放入水箱中25摄氏度通入氧气，喂食，备用。
2.1.1 青虾
原材料所用的青虾取自学校附近的水产市场。买回来的青虾立刻放入水箱中25摄氏度养，通入氧气，喂食，备用。
2.1.2 试剂
0.02%秋水仙素水溶液
0.070mol/L、0.075mol/L、0.080mol/L氯化钾低渗液
卡诺氏固定液
吉姆萨原液
PH7.2磷酸盐缓冲液
2.1.3 试剂配制
0.02%秋水仙素水溶液：10mg的秋水仙碱和180mg的氯化钠溶于20ml的蒸馏水中（避光保存）
0.070mol/L氯化钾低渗液：0.521g KCL溶于100ml蒸馏水中（现配现用）
0.075mol/L氯化钾低渗液：0.559g KCL溶于100ml蒸馏水中（现配现用）
0.080mol/L氯化钾低渗液：0.596g KCL溶于100ml蒸馏水中（现配现用）
卡诺氏3:1固定液：甲醇和冰乙酸按体积3:1 混合（现配现用）
卡诺氏1:1固定液：甲醇和冰乙酸按体积1:1 混合（现配现用）
吉姆萨使用液：吉姆萨原液和磷酸盐缓冲液按体积1:9 配制（棕色瓶保存）
2.1.4 仪器与器具
电子称重计，水浴锅，Olympus显微镜，移液枪，离心管，镊子，剪刀，离心管，烧杯，量筒，载玻片，研钵
2.2 方法
2.2.1 注射秋水仙素
取10尾雄虾，10尾雌虾，按每5g注射0.1ml的标准向青虾腹部的一对腹肢底部注射秋水仙素[11]。然后放入水箱中养4至6个小时。
2.2.2 解剖取组织
取出青虾，分辨雌雄，取雄虾的肝胰脏，腮部进行切片，取雌虾的肝胰脏，腮部进行切片，用镊子，剪刀将腮部和肝胰脏剪碎置于离心管中，由于肌肉组织块较大，不易剪碎，所以将解剖出的肌肉置于研钵中，加入生理盐水和石英砂进行研磨，研磨后进行过滤、离心，得到细小的肌肉碎末，置于离心管中，将每个离心管标注好性别和组织部位，便于总结。
2.2.3 低渗
将上述准备好的离心管都加入低渗液，经查文献得知低渗是本实验的关键，需对低渗液浓度和低渗时间进行确切的把控，所以本实验对低渗浓度和低渗时间进行了梯度分类，设计了两种方案，如下：
A 低渗浓度梯度：分别取浓度为0.070mol/L、0.075mol/L、0.080mol/L氯化钾低渗液，低渗时间都为1小时15分钟，水浴锅温度为40℃。
B 低渗时间梯度：取浓度为0.075mol/L氯化钾低渗液，低渗时间分别为1小时15分钟，1小时30分钟，1小时45分钟，水浴锅温度也为40℃。
2.2.4 固定
从水浴锅中取出离心管，用移液枪吸去低渗液，加入甲醇：冰乙酸 为3:1 的卡诺氏
固定液，固定15min，再更换固定液，中间更换固定液三次，固定40min[11]。（每次吸去旧固定液的时候留一点打悬浮，再加新的到同一位置）。
然后加入甲醇：冰乙酸 为1:1 的卡诺氏固定液在4摄氏度（冰箱）放置1天。
2.2.5 解离与制片（压片与滴片）
压片法：将组织块取出置于载玻片上（载玻片上滴加几滴50%的冰乙酸）用镊子轻轻捣碎[11]，再滴入几滴 1：1的固定液浸没捣碎过的组织，室温下自然风干。
滴片法：用移液枪将底部碎末吸出，在比较高的地方往下滴于载玻片上（滴之前载玻片要置于冰箱中冷藏一段时间），室温下自然风干。
2.2.6 染色
用配制好的吉姆萨使用液染色30 min，用蒸馏水洗去多余染液, 在空气中自然干燥[11]。
2.2.7 观察
于Olympus显微镜下观察计数和拍照，照片放大后，进行染色体数目的分析。
3 结果与分析
3.1最佳条件的选定
3.1.1最适低渗浓度的选择
表1 不同低渗浓度对能否观察到染色体的影响
低渗温度（℃） | 低渗液浓度（mol/L） | 低渗时间 | 能否观察到染色体 |
40 | 0.070 | 1小时15分钟 | — |
40 | 0.075 | 1小时15分钟 | — |
40 | 0.080 | 1小时15分钟 | — |
（ ：能观察到染色体 —：不能观察到染色体）
分析： 由上表可以看出低渗液浓度的变化对能否观察到染色体没有影响，故可以选择浓度为0.075mol/L的氯化钾浓度。此浓度与邱高峰[11]之前对青虾所选取的低渗浓度一致。
3.1.2最佳低渗时间的选择
表2 不同低渗时间对能否观察到染色体的影响
低渗温度（℃） | 低渗液浓度（mol/L） | 低渗时间 | 能否观察到染色体 |
40 | 0.075 | 1小时15分钟 | — |
40 | 0.075 | 1小时30分钟 | — |
40 | 0.075 | 1小时45分钟 |
|
（ ：能观察到染色体 —：不能观察到染色体）
分析：由上表可知当低渗时间为1小时45分钟时，能够观察到比较清晰且分散比较良好的染色体。此低渗时间与邱高峰[11]之前对青虾所选取的低渗时间20—30min相差较大。
3.1.3最佳制片方法的选择
表3 不同制片方法对染色体分散的影响
制片方法 | 组织部位 | 染色体分散情况 |
压片 | 腮 | 优 |
压片 | 肌肉 | 良 |
压片 | 肝胰脏 | 良 |
滴片 | 腮 | 差 |
滴片 | 肌肉 | 差 |
滴片 | 肝胰脏 | 差 |
分析：由上表可知，压片法在染色体分散的良好程度优于滴片法。
3.2青虾染色体数目的确定
表4 青虾染色体数目的统计
组织部位 | 染色体数目 | 频率 | 百分比% |
腮 | 67 | 1 | 5 |
78 | 3 | 15 | |
88 | 13 | 65 | |
97 | 2 | 10 | |
104 | 1 | 5 | |
肝胰脏 | 64 | 1 | 5 |
68 | 1 | 5 | |
79 | 2 | 10 | |
88 | 12 | 60 | |
98 | 3 | 15 | |
102 | 1 | 5 | |
肌肉 | 68 | 1 | 5 |
78 | 2 | 10 | |
88 | 12 | 60 | |
102 | 3 | 15 | |
104 | 2 | 10 |
图1，2 青虾染色体中期分裂相（1000×）
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