论文总字数：17544字

摘 要

多发性骨髓瘤(MM) 是目前一种恶性浆细胞疾病，其特征是单克隆浆细胞会发生恶性增殖的同时分泌出大量的单克隆免疫球蛋白。在血液系统恶性肿瘤中，其危险性首屈一指，主要因其耐药性强且复发风险高导致无法根治。肿瘤干细胞或癌干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）具有自我更新、无限增殖和多向分化的潜能，是MM形成、发展、耐药和复发的根源。其耐药机制复杂，如高表达抗凋亡基因等。因此，针对CSCs设计新型药物杀灭CSCs，是根治MM的有效策略。高三尖杉酯碱（HHT）是抑制细胞DNA和蛋白质合成，促进细胞凋亡的抗肿瘤药物，临床用于治疗实体肿瘤、恶性血液病等。但其生物相容性差、半衰期短及毒副反应多。纳米药物载体可提高抗肿瘤药物的生物相容性、延长药物半衰期、增加其被动靶向性和降低药物不良反应，从而增强抗肿瘤效应。

因此，为解决MM耐药、复发以及HHT半衰期短、毒副作用多等问题，本研究旨在采用新型纳米药物即高三尖杉酯碱长循环脂质体对比HHT传统剂型，在体外及荷MM小鼠模型上，研究该药对人MM的作用和机制。为提高MM的治疗效果和治愈率提供新思路和方法。

目的：

探讨高三尖杉酯碱长循环脂质体对人MM的作用和机制，为其临床广泛应用提供实验依据。

方法

1. 高三尖杉酯碱长循环脂质体对人MM体外作用的研究：

通过细胞增殖实验、软琼脂克隆形成实验以及细胞凋亡实验，检测该药物对RPMI8226 细胞的体外作用

2.高三尖杉酯碱长循环脂质体对人MM体内作用的研究：

通过NOD/SCID小鼠皮下成瘤模型检测该药物的体内抗肿瘤效应。

结果：

1.通过细胞培养、传代、冻存、复苏获得了大量的MM RPMI8226细胞。

2.高三尖杉酯碱长循环脂质体作用于RPMI8226细胞后，可抑制细胞增殖，降低细胞软琼脂克隆形成率及诱导细胞凋亡，较其他治疗组药物作用显著，差异有统计学意义（P 0.05）。

3.高三尖杉酯碱长循环脂质体组的小鼠瘤体大小显著小于其他治疗组，差异有统计学意义（P 0.05）。

结论：

高三尖杉酯碱长循环脂质体对人MM RPMI8226细胞有抑制作用，其机制可能与药物诱导细胞凋亡有关。

关键词：多发性骨髓瘤；癌干细胞；高三尖杉脂碱；高三尖杉酯碱长循环脂质体

Study of homoharringtonine long circulating liposomes on human multiple myeloma (cancer stem cells)

No.41111122 Student: Xingtian Zhan

Supervisor: Jun Dou

Laboratory of Pathogen Biology and Immunology, Ministry of Education Southeast University

Abstract

Multiple myeloma (MM) is a kind of malignant plasma disease, characterized by monoclonal plasma cells  malignant proliferation and secrete malignant proliferation of monoclonal immunoglobulin. In former blood system of malignant tumor, and its dangers, mainly because of its strong resistance and high risk of recurrence in cannot effect a radical cure. Cancer stem cells (CSCs) has the potential of self-renewal, unlimited proliferation and multi-directional differentiation, is the formation and development of MM, the root of the resistance and relapse. The resistance mechanism is complex, such as the high expression of antiapoptotic gene, etc. Therefore, in view of the resistant mechanism of CSCs design new drugs to kill CSCs, is an effective strategy to effect a radical cure MM. Homoharringtonine (HHT) is the inhibition of cell DNA and protein synthesis, promote apoptosis of antineoplastic drugs, clinical used in the treatment of solid tumors and hematologic malignancies, etc. But the poor biocompatibility, short half-life and adverse reaction. Nano drug carrier can improve the biocompatibility of drugs, extend biologic half life of drug and increase its passive targeting and reduce adverse drug reactions, thus enhance antitumor effect.

Objective

Discuss homoharringtonine long circulation liposomes of MM and its function and mechanism of CSCs, provide experimental basis for its widely clinical application.

Methods and Contents

1. The homoharringtonine long circulation liposomes of MM in vitro study:

Through the cell proliferation experiment, soft AGAR cloning formation experiment and cell apoptosis, testing the drug on RPMI8226 cell in vitro

2. Homoharringtonine long circulation liposomes for MM body of research:

Subcutaneous tumor model testing in immunodeficient NOD/SCID mice in vivo antitumor effect of the drug.

Results

1. Through cell culture, batches, frozen storage, recovery acquired a lot of MM cells.

2. Homoharringtonine long circulation liposomes in RPMI8226 cell of cell proliferation inhibition rate, soft AGAR cloning formation rate and apoptosis rate compared with other drug treatment group, the difference was statistically significant (P lt; 0.05).

3. Homoharringtonine long circulation liposomes group of tumors size in mice significantly less than other treatment group, the difference was statistically significant (P lt; 0.05).

Conclusions:

Homoharringtonine long circulation liposomes have to inhibit the action of the MM. The mechanism may be related to apoptosis induced by drugs.

Key words: Multiple myeloma ; Cancer stem cells ; Homoharringtonine ;

Homoharringtonine long circulating liposome

目录

中文摘要 II

Abstract Ⅳ

第一章 绪论 7

1.1研究背景 7

1.2研究目的和内容 8

1.3技术路线 8

1.4纳米粒子递呈药物对肿瘤治疗影响的研究 8

第二章 材料和方法 12

2.1 实验材料和试剂 12

2.1.1细胞和NOD/SCID小鼠 12

2.1.2试剂 12

2.1.3主要仪器设备 13

2.2 实验方法 13

2.2.1细胞的培养、冻存、复苏和传代 13

2.2.2细胞增殖实验 14

2.2.3软琼脂克隆形成实验 15

2.2.4荷MM小鼠模型构建 14

第三章 实验结果及讨论 15

参考文献 21

致谢 22

绪论

研究背景

多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性肿瘤疾病（B细胞所引起）。尽管随着越来越多的化疗药物的出现及自体干细胞移植的应用，对MM的治疗效果得到明显改善，但因其耐药性和高复发风险，该病仍属于不治之症。疾病的复发现象表明肿瘤细胞的耐药性，而大部分浆细胞的自我增殖和更新的能力是低下的，在MM中仅有一小部分细胞具有无限增殖能力，促进着疾病的继续恶化，这部分细胞即是所谓的多发性骨髓瘤干细胞（MM CSCs）。随着科技的发展，近年来干细胞生物学和肿瘤学研究的不断深入，CSCs是肿瘤发生的起源细胞这一观点越来越受到学者们认同。迄今，结合其他肿瘤疾病，例如在白血病、脑肿瘤、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中均检测出CSCs。

当下，纳米材料作为抗肿瘤药物载体成为医学工作者研究的的焦点。目前现有的抗肿瘤药物大多存在半衰期短、特异性差及毒副反应多等缺点。因此如何做到在将药物运送到细胞内的同时，对人体的正常细胞损伤降至最低成为了研究的关键。而纳米技术的发展为此提供了可能性，脂质体等纳米药物载体改变药物的结构修饰和半衰期，增加药物在细胞内的水溶性，从而使药物获得靶向性，让药物在肿瘤内的存留时间大大增加，减少给药次数和毒性反应，延长了荷瘤体的存活时间。

在众多纳米材料中，长循环脂质体是极具应用前景的, 其在传统的脂质体上，表面构造由天然或合成聚合物所修饰而成的。结构上的变化对其性质有了调整，增加在血液中保存的时间, 进而延长药物的作用时效。而长循环脂质体延长药物疗效的本质在于延长血循环的时间。现有的长循环脂质体大都是PEG及其衍生物所修饰的脂质体：PEG化脂质体。现在，对于PEG化脂质体为何能延长血循环时间的机理上还不能清晰的确定, 猜测有两个可能性：其一，由于外部结构的改变，导致长循环脂质体的膜表面亲水性大大提高。其原理涉及到PEG的性质，正因为PEG为极性团，才能整体增加脂质体表面的亲水性，影响了分子间调理作用，同时降低亲和作用。另一个原因被称为立体位阻假说，依据PEG的自身性质在脂质体表面覆盖后聚集而形成阻层，自然影响到了血液中其他分子间的运动及作用。在两个原因的诱导之后，PEG修饰在脂质体上成为一种新型脂质体即长循环脂质体。

1.2研究目的和内容

1.2.1研究目的

探讨高三尖杉酯碱长循环脂质体对人MM的作用和机制，为其临床广泛应用提供实验依据。

1.2.2研究内容

1）细胞培养：通过细胞培养、冻存、传代获得大量的RPMI8226细胞，为下一步试验作准备。

2）用两种药物即高三尖杉脂碱市场药、高比例PEG脂质体药体外作用于RPMI8226细胞，分别检测药物对细胞增殖、克隆形成能力及凋亡的影响。

3）于NOD/SCID小鼠腹股沟皮下注射RPMI8226细胞悬液种瘤，分别用以上两种药物治疗，观察小鼠肿瘤生长情况，比较各药物疗效。

1.3技术路线

1.4纳米粒子递呈药物对肿瘤治疗影响的研究

摘要：目前对于治疗肿瘤的方法极具局限性，在常规的几种方法中，手术风险性高，而化疗和放疗虽然能够有效地杀死癌细胞，但这把双刃剑不可避免的是正常细胞亦要受到巨大的损伤，对人体的破坏不可忽视。考虑到这些因素，纳米粒子的优势吸引着研究者的目光。较之传统方法，纳米作为药物载体可以将化疗药物直接递送至肿瘤，保护药物在进入细胞的过程中不被破坏，因此也提高了药物的吸收效果。与此同时，纳米药物载体能帮助药物更均匀的分散到各个组织和器官，防止了与正常的细胞直接产生接触，以规避了伤害正常细胞的风险。诸多优势下，自然成为了研究的重点，对于患者而言更是新的希望之光。

关键词：纳米粒子；肿瘤；药物递呈

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