南京某河蟹养殖水环境中四环素类抗生素抗性细菌及抗性基因初步研究

论文总字数：18644字

目 录

1.引言 5

1.1 研究背景 5

1.2 国内外研究现状 5

1.3 长三角地区河蟹养殖概况 6

1.4 研究目的与意义 6

2.材料和方法 7

2.1 实验仪器和材料 7

2.2 样品采集和处理 7

2.3 四环素类抗性细菌耐药性实验 8

2.4 四环素类耐药细菌的基因组DNA提取实验 8

2.5 沉积物样品中的DNA提取实验 8

2.6 四环素类抗性细菌菌种鉴定实验 9

2.7 四环素抗性基因荧光定量PCR检测 9

3.结果和讨论 9

3.1 四环素类抗性细菌总数及耐药率 9

3.2 四环素类抗性细菌的鉴定及分布 12

3.3 河蟹养殖区四环素类抗性基因的检出及分布 12

4.结论及展望 14

参考文献： 14

致谢： 17

南京某河蟹养殖水环境中四环素类抗生素抗性细菌及抗性基因初步研究

阿依努尔·库尔曼

( China）

Abstract:Antibiotics is widely used in prevention and treatment of human beings, poultry and aquaculture in various diseases,which contributes greatly to the development of human society.Due to the lack of scientific management and the corresponding institutional constraints, resistance genes pollution caused by the blind use and abuse of antibiotics has become increasingly serious problem.Once the resistance genes are released into the aquatic environment it will not only threaten the farming area and its surroundings, but also get into the pathogens and other environmental bacteria through a variety of molecular and genetic levels and drive the super bugs, which will cause security risk to human health.. At present most of the researchers has studied antibiotic resistance genes in aquaculture fish, shrimp ,environment and ecological risk assessment of antibiotic resistant bacteria and resistance genes were yet been established for crab farming,It is necessary to carry out the investigation on distribution and resistance genes of resistant bacteria in crab farming area.Based on the Nanjing vicinity crab farming area to investigate, we did a systematical study on the resistant bacteria and resistance genes.Distribution of Tetracycline antibiotic resistant bacteria, dissemination and potential danger of resistance gene are reviewed in this passage.And introduced the detection method of resistance gene.points out the necessity to carry out contamination of antibiotic resistance genes in crab aquaculture recommends that the Government and relevant departments should carry out the polluted mechanism and control measures in aquaculture on antibiotic resistance genes as soon as possible.

Key words:Crab farming;Tetracycline ;Resistance gene,;bacterial resistance rates;PCR detection

1.引言

1.1研究背景

自1928年Alwxander^[1]发现盘尼西林能裂解葡萄球菌至今已80余年，抗生素被大量生产并广泛应用于医疗和农业方面，最终变成了临床上重要的一类抗感染药物，大大促进了人类社会的发展。四环素类抗生素是最为常见的抗生素之一，它的水溶性好、化学性质稳定、治疗效果好、价格低廉、广谱抗菌等特点，使其在养殖业中很受欢迎。已经有研究发现四环素具有能够抑制细菌蛋白质合成的氢化骈四苯基本母核^[2]，因此在畜禽和水产养殖业中被广泛用作细菌感染疾病的治疗剂和饲料添加剂。在低剂量添加四环素时可以促进养殖动物的生长，提高饲料利用率，也可以降低养殖动物对某些营养成分的需求量，从而提高其生长生产效率等。而高剂量使用时又可以用来预防或治疗水产动物（如虾、蟹、蛙、鱼类、贝类等）的白吱病、腐皮病、鲤鱼烂鳃病等细菌性疾病。常用的主要四环素类有（Tetracycline,TC）、土霉素（Oxytetracycline, OTC）、多西环素（Doxycycline, DXC）、美他环素（Methacycline, MTC）等。^[3]

四环素类抗生素有多种使用方式，一般内服是其中常见的方式，有时也可以浸洗或全池泼、洒等方式使用，有些情况下则用腹腔注射或肌肉注射的方式给药。四环素类抗生素只有部分被养殖动物代谢吸收，而大部分随其生理代谢活动流入到水体或者沉积在底泥。它们会在肠道细菌和环境细菌中诱导产生抗性基因。随着抗性基因的大量流入水产环境它们就会富集，从而造成抗药性菌群及抗性基因的演变和传播。最终对养殖区域和周围环境带来抗性基因污染等问题，而且还会通过各种分子和遗传水平进入到其他致病菌和环境细菌中，衍生出超级细菌等。这些致病菌和耐药菌无形中通过直接或间接的方式进入人体，增强人体的耐药性甚至直接危害人类身体健康。比如造成人体胃肠道的不适，其常见的表现为恶心、呕吐、腹胀、腹泻等症状，也会影响血液系统从而引发溶血性贫血、血小板减少、中性粒细胞减少等。

1.2国内外研究现状

目前有很多国内外专业人士已经研究了各类养殖场废水、污水处理厂、医疗废水、河流等不同环境中的四环素与其抗性基因，据数据统计已经至少有40种四环素类抗性基因存在^[4]。我国近几年也在北京、天津等地的内陆河流、流域地表水、畜牧养殖厂、污水处理厂以及水产养殖场中陆续发现了四环素类和磺胺类抗性基因^[5]。

Miranda等人^[6]对智利的几个鲑鱼养殖场进行抗性基因的研究，最终检测出了25种不同的抗四环素的细菌，经分析发现该耐药菌的44%携带tetA、tetB和tetE基因。Gao等^[7]研究天津地区的水产养殖场也检测出了tetM、tetO、tetT、tetW、sul1及sul2等。Di Cesare等^[8]在地中海沿岸的养鱼场中检测出了tetM、tetO、tetL、tetK、ermB、ermA和ermC等抗性基因，但是该渔场并没有在饲料中添加任何抗生素，这可能是因为海水养殖导致了抗性基因的水平转移。很多资料表明环境中的抗性基因可以通过各种水平进入人体使人类的致病菌携带抗性。Furushita等^[9]在日本几个不同养鱼场进行的研究就可以证明这一点。他们在日本3个养鱼场采集的鱼中检测出基因序列和从人类临床分离的菌株中的基因序列高度相似的抗四环素类菌株。Zhang等^[10]分别到我国15个污水处理厂采集其活性污泥样品，并通过实验在所有样品中检出了tetA、tetC、tetG、tetM、tetS和tetX等6种抗性基因。那广水等^[12]在我国北方地区的一些污水处理厂中检测出的四环素类抗生素的平均浓度最高时为1114ng/L。有研究发现不管是耐药菌和其抗性基因的数量还是浓度在医疗废水中都比生活污水中的水平要高^[11]。

养殖场水环境、其沉积物以及周围的土壤、空气等已经成为了抗生素抗性基因的主要来源之一。随着各类抗生素在养殖业、医疗、农业等中的大量使用，细菌耐药性逐渐由单一耐药性发展为多重耐药性。多重耐药（Multiple Drug Resistance）指一种细菌同时可以对多种抗生素产生抗性^[13]。目前已经有很多研究能够证明多重抗药菌株和其基因型在水产养殖场动物体内和环境中普遍存在。Jun等从韩国养殖场采集的养殖鱼体内分离出多种抗性菌株，经分析发现其中有20个菌株除了抗四环素外还对萘啶酸、恶喹酸、氯霉素和链霉素等抗生素也有抗性^[14]。

因为与抗生素具有同样疗效的替代产品目前比较少，所以细菌性疾病的预防与控制主要靠抗生素来解决。但是由于相关部门对养殖场的管理不够科学又缺乏相应制度的制约等原因导致养殖户的素质层次不齐。为了追求产量与预期疗效，养殖户在饲料中长期添四环素甚至超量或滥用抗生素，使得养殖场内和周围环境中普遍存在抗生素。

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