2,4-二氯苯酚羟化酶表达条件优化及其在靛蓝转化中的应用

论文总字数：24614字

摘 要

目的：对重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)进行条件优化，寻找该重组菌生物转化靛蓝的最佳条件。方法：对tfdB基因进行优化，构建重组质粒pET28a/tfdB，将重组质粒转入到大肠杆菌BL-21中，得到重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)；对重组大肠杆菌进行培养、诱导和表达2,4-二氯苯酚羟化酶，加入底物色氨酸生物转化靛蓝；利用控制变量法对重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)进行条件优化，第一方面是对重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)的表达条件进行优化，即考虑底物色氨酸浓度、诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度和转化时间；第二方面是对重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)的生长条件进行优化，即考虑种龄和接种量因素。结果：重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)生物转化靛蓝的最佳条件为：种龄8小时，接种量1.5%，诱导剂IPTG浓度为0.2mmol/L，诱导时间为2小时，诱导温度35℃，底物色氨酸浓度为0.2%，转化时间为17小时。在此条件下，重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)生物转化靛蓝的最大转化量为39.23mg/L。结论：本实验成功探索到重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)生物转化靛蓝的最佳条件，并为该菌应用于靛蓝的工业化生产点后续实验研究奠定了一定的基础。此外，在实验中还发现：以色氨酸作为底物，重组大肠杆菌E.coli BL-21(pet28a/tfdB)可以转化生成靛蓝，而以吲哚为底物却不能合成靛蓝。目前所研究过的氧化酶催化机制中，吲哚都是色氨酸到靛蓝的第一个降解产物，2,4-二氯苯酚羟化酶转化色氨酸为靛蓝是否存在一种新的催化途径，值得做进一步的探讨。

关键字：重组大肠杆菌E.coli BL-21(pet28a/tfdB)；靛蓝；2,4-二氯苯酚羟化酶

EXPRESSION OPTIMIZATION OF 2,4-DICHLOROPHENOL HYDROXYLASE AND ITS APPLICATION IN THE BIOSYNTHESIS OF INDIGO

Chong Gu (41111112)

Supervisor: Xudong Xu

ABSTRACT

Objective: Optimize expression of E.coli BL-21(pET28a/tfdB), find its best optimum conditions of biotransformation of indigo. Methods: Optimize the tfdB gene, and construct the plasmid pET28a/tfdB. Transform the plasmid into E.coli BL-21, and obtain the recombinant E.coli BL-21(pET28a/tfdB). After culturing the recombinant E.coli BL-21(pET28a/tfdB) and inducing the objective protein, the medium was added with Tryptophan, then the recombinant E.coli BL-21(pET28a/tfdB) express indigo. Use the control variable method for E.coli optimization. The first aspect, optimize expression of E.coli BL-21(pET28a/tfdB) including Try concentration, IPTG concentration, induction time, induction temperature and conversion time. The second aspect, optimize growth conditions of E.coli BL-21(pET28a/tfdB) including species age and inoculum. Results: The best conditions of the recombinant E.coli BL-21(pET28a/tfdB) are species age 8 hours, inoculum 1.5%, IPTG concentration 0.2mmol/L, induction time 2 hours, induction temperature 35℃ and conversion time 17 hours. Under this condition, the maximum amount of conversion of the recombinant E.coli BL-21(pET28a/tfdB) is 39.23mg/L. Conclusion: This experiment has successfully found the best conditions of the recombinant E.coli BL-21(pET28a/tfdB) biotransformation indigo. This work plays an important role in the future research about the industrialized production of indigo. Moreover, we also find that the recombinant E.coli BL-21(pET28a/tfdB) can use Try to synthesize indigo, but can not use indole to synthesize indigo. As we all know, in the current study of oxidase catalytic mechanism, the first degradation product of Try to indigo is indole. So, it is worth to do more further exploration that is there a new catalytic pathway of 2,4-dichlorophenol hydroxylase conversion of Try to indigo.

Key words: recombinant E.coli BL-21(pET28a/tfdB),indigo, 2,4- dichlorophenol hydroxylase

目录

中文摘要………………………………………………………………………..…………….I

Abstract………………………………………………………………………………..……..II

第一章 绪论……………………………………………………………….…………………1

1.1 靛蓝概述及其应用…………………………………………………………………1

1.2 靛蓝合成法的概述…………………………………………………………………2

1.2.1 靛蓝的天然提取法……………………………………………….…………2

1.2.2 靛蓝的化学合成法……………………………………………….…………3

1.2.3 靛蓝的生物合成法……………………………………………….…………4

1.3 靛蓝生物合成途径探究……………………………………………..…….………5

1.3.1 双加氧酶合成途径………………………………………………….………5

1.3.2 单加氧酶合成途径………………………………………………….………6

1.4 本实验的研究思路及目标………………………………………..……….………7

第二章 实验材料及方法…………………………………………………………….………8

2.1 实验材料………………………………………………………………..….………8

2.1.1 菌株、质粒、目的基因……………………………………………….……8

2.1.2 培养基及其成分……………………………………………………….……8

2.1.3 主要试剂……………………………………………………………….……8

2.1.4 主要仪器及设备……………………………………………………….……9

2.2 实验方法……………………………………………………………………………9

2.2.1 tfdB基因的优化、合成、克隆及转化…………………………….………9

2.2.2重组菌的培养、目的酶的诱导表达及靛蓝的合成………………………10

2.2.3 靛蓝标准曲线制作…………………………………………………………11

2.2.4 影响靛蓝合成的因素探讨…………………………...…………….………11

第三章 结果与讨论…………………………………………………………………....……12

3.1 重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)的表观特征………………….………12

3.2重组大肠杆菌E.coli BL-21(pET28a/tfdB)生物转化靛蓝…………….….………13

3.3 靛蓝标准曲线制作……………………………………………………..….………13

3.4 影响靛蓝合成的因素探讨………………………………………………...………14

3.4.1 直接底物色氨酸浓度对靛蓝合成的影响…………………………………14

3.4.2 诱导剂IPTG浓度对靛蓝合成的影响……….……………………………16

3.4.3 诱导时间对靛蓝合成的影响………………………………………………17

3.4.4 转化时间对靛蓝合成的影响………………………………………………17

3.4.5 诱导温度对靛蓝合成的影响………………………………………………18

3.4.6 接种量对靛蓝合成的影响…………………………………………………19

3.4.7 种龄对靛蓝合成的影响……………………………………………………20

第四章 小结…………………………………………………………………………………21

参考文献……………………………..………………………………………………………22

致谢………….………………………….……………………………………………………24

第一章 绪论

前言

靛蓝是最早发现的天然染料之一，目前广泛应用于食品、医药和印染工业。靛蓝可以从植物中提取，也可以通过化学合成法获得，但是前者得到的靛蓝质量和产量都不能满足工业需求，而后者具有潜在的致癌作用^[1]，所以人们逐渐将目光投放到绿色、可持续发展的生物催化法。最早在1928年就有报道利用微生物制备靛蓝^[2]，该报道称从土壤中分离得到一株氧化吲哚假单胞菌，该菌能将吲哚转化成靛蓝。至今，从自然界中分离得到若干具有靛蓝合成能录的菌株，这些菌株中通常含有芳烃加氧酶的基因，能够通过双加氧、单加氧或环氧化途径催化吲哚合成靛蓝。但是野生菌株的酶活一般比较低，因此科学家们采用基因工程技术对酶进行改造，以期望获得性能更加优良的转化酶，其中苯酚羟化酶就是一种能转化成靛蓝的酶，因此本文将概述靛蓝及其应用、靛蓝的合成方法、靛蓝生物合成的途径研究和本实验的思路及目标。

正文

1.1靛蓝的概述及其应用

靛蓝（Indigo），又名食品蓝1号、食用青色2号、食用蓝、硬化靛蓝、酸性靛蓝，为水溶性非偶氮类着色剂。靛蓝分子式为C₁₆H₁₀N₂O₂，相对分子质量262.26。靛蓝的结构式如图1.1所示^[3]：

图1.1 靛蓝的结构式

常见靛蓝的外观为蓝色粉末，其熔点为390-392℃。靛蓝的水溶性小于千分之一，能溶于丙二醇和甘油，微溶于乙醇，不溶于油脂。它的化学性质为遇到浓硫酸呈现出深蓝色，进行稀释后呈现蓝色，它的水溶液加入氢氧化钠呈现出绿色至黄绿色。靛蓝的耐热性和耐光性比较差，对碱和柠檬酸和酒石酸都不稳定。

靛蓝类色素用途越来越广泛，在全世界各地都已经被普遍使用，主要用途在一些印染行业、食品行业、医药行业以及化妆品行业等等^[4-6]。

在印染行业中，靛蓝可以算是一种古老的染料，它的应用历史可以追溯到三千多年以前，从古代埃及木乃伊身上的服饰到我国汉代马王堆出土的蓝色麻织物中都能发现靛蓝的存在。到如今，现在流行的牛仔裤上面的蓝色也大多数都是靛蓝染织的。之所以靛蓝能够长久地被人们所喜爱并且广泛使用，是因为它在染着坚牢度和耐光坚牢度上由其他染料无法超越的优势，因此，靛蓝也被人们成为“染料之王”^[5-6]。

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