裂殖酵母染色体分离相关基因的研究

论文总字数：35822字

摘 要

在真核生物有丝分裂过程中,复制的染色体的忠实分离是维持遗传稳定性的重要条件。细胞分裂异常的主要表现是染色体的不对称分离,在多种肿瘤及许多遗传性疾病中都涉及到染色体分离不均。姊妹染色体分离是以纺锤体微管与染色体的动粒体(kinetochore)连接为基础的,再通过纺锤体微管在其末端解聚迫使染色体向两极运动而实现。为保证姊妹染色体的对称分离,每条姊妹染色体的动粒体必须与分别来自两极的相同数目的纺锤体微管连接。我们调研发现,裂殖酵母中的蛋白Dcn1参与染色体分裂的调控。本实验中将通过一系列分子生物学以及遗传学手段将野生型裂殖酵母中Dcn1基因删除得到dcn1△突变株，然后PCR验证并与野生型酵母株进行表型比较。

关键词：裂殖酵母, Dcn1, PCR，基因删除，转化

Study on the chromosome segregation related genes of fission yeast

41111115 Shan Shihao

SUPERVISOR:Lin Lan

Abstract

During mitosis, faithful chromosome separation is critical for the maintenance of the

genetic stability. The main manifestation of cell division abnormality is the asymmetric

separation of chromosomes, which involves chromosome segregation in many tumors

and many genetic disorders. Sister chromatid separation is based on spindle microtubules

to spindle microtubules, which is achieved by the depolymerization of spindle microtubules driving the spindle. In order to ensure the symmetric separation of sister chromosomes,

each sister chromatid must be properly attached to the spindle microtubules emanating from opposite spindle poles. We found that fission yeast nuclear protein Dcn1 might participate in the regulation of chromosome segregation, thereby necessitating for the maintenance of chromosome number stability. This study, through a series of molecular biology and genetics approaches, made dcn1 deletion (dcn1△) mutant strain of fission yeast via homologous recombination, followed by PCR verification of dcn1△. Chromosome loss assay was

performed in dcn1△ in contrast to wild-type fission yeast to display their different chromosome segregation behavior.

Key Words: Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe), Dcn1, PCR, Gene Deletion,

Transformation

目 录

第一章 绪论 4

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料 7

2.2 实验方法 8

第三章 实验结果

3.1 引物设计结果 16

3.2基因删除所需DNA的PCR扩增结果鉴定 17

3.3 PCR验证Dcn1基因的删除 18

3.4 Dcn1基因删除株表型 18

第四章 总结与讨论 19

致谢 20

参考文献 21

第一章 绪论

1.1引言

裂殖酵母属于子囊菌亚门、酵母科中的裂殖酵母亚科。而酵母作为一种真核生物，其染色体分离也具有真核生物的共性。酵母细胞的染色体分离异常的表现与其他高等生物也十分类似。非整倍体是其中最为突出的表型。它是指与正常细胞染色体数目的差异，导致细胞中整条染色体的缺失或增多。在多数情况下，非整倍体是染色体分离机制缺陷导致的有丝分裂错误引起的，如纺锤体装配检查点（SAC）的机制的缺陷。SAC-缺陷小鼠易发生肿瘤的现象表明，该检查点在抑制肿瘤形成中的重要性，而且非整倍体可诱发肿瘤。

1.2非整倍体的形成路径

在细胞周期中最有可能发生细胞倍性错误的地方是有丝分裂期中将复制的基因组分到两个子细胞的时候。大量的分子调控机制确保姐妹染色单体的精确分离。这些机制的异常引起染色体的错误分离。

1.2.1纺锤体装配检查点的破坏

在酿酒酵母中，SAC功能的受损将会导致染色体丢失率上升，尽管检查点在细胞生存中^[1-4]不是必不可少的。在秀丽线虫、果蝇和老鼠的一系列研究中都表现出了SAC在染色体稳定性维护以及生物体^[5-11]的生存中的必要性。同时还发现SAC突变细胞中出现很高的有丝分裂错误率（例如染色体迟滞），导致非整倍体细胞^[6-12]百分比的显著增加。

值得一提的是，纺锤体装配检查点不是“全或无”的绝对性概念。一些SAC组件，如MAD1，Mad2的，BUB1和BUBR1在小鼠中只是单倍体不足的。这些基因的一个拷贝的缺失导致SAC功能部分缺失，其表现为有丝分裂错误的发生率增加，但剩余的SAC功能足以保证其生存能力。此外，不仅SAC成分的损失会导致检查点中断，其过度表达同样也可以导致这种现象，例如Mad2^[13]的过表达。在人类癌症患者中也广泛观察到纺锤体装配检查点的错误调节是通过突变或损失/增益SAC组件的表达引起的。例如，BUBR1（BUB1B）突变的MVA，导致在口腔鳞状细胞癌^[14]、肝癌^[15]、透明细胞肾癌^[16]、膀胱癌^[17]和胃癌^[18] 过度表达，而在结肠腺癌^[19] 低表达。

1.2.2中心体异常

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