论文总字数：24951字

摘 要

实验背景：

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是古老的核酸领域的一个新兴研究热点。模式生物秀丽线虫是可以用于研究RNA的生物模型，而在线虫中lncRNA的具体生物学功能及其作用机制尚不完全清楚。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是经典的纳米材料，也是研究纳米材料的生物安全性的常用材料。前期的组学分析显示秀丽线虫体内lncRNA linc-14，linc-24，linc-37及linc-83等在GO暴露下表达水平均下降，而linc-3等在GO的作用下表达水平上升。因此初步推测linc-14等对于GO具有抗性，而linc-3等对GO表现敏感。本课题拟在组学分析的基础上，以lncRNA为核心，进一步分析GO调控秀丽线虫RNA的表达而导致的毒性效应。

实验目的：

本课题的开展将有助于理解秀丽线虫中lncRNA分子的生物学功能，并更深入揭示GO的毒性效应。

实验方法：

用饲喂法对野生型秀丽线虫进行RNAi处理，获得相应的突变型。经同步化处理后分别进行GO暴露，评价GO暴露的处理组与未经GO暴露的对照组的运动行为、ROS和生存曲线。

实验结果：

野生型与突变型秀丽线虫的对照组与实验组的生存曲线、运动行为以及肠道ROS均证实了GO对线虫具有毒性效应，体现在降低线虫寿命，影响线虫运动以及激发线虫肠道荧光等指标上。突变型linc-14 RNAi，lin-37 RNAi和linc-83RNAi的寿命测试与运动行为均显示了GO的毒性并不会对它们产生实质性的影响，暗示了linc-14 RNAi，lin-37 RNAi和linc-83RNAi对于GO具有抗性。随后的肠道ROS分析则证实了上述结果。

关键词：氧化石墨烯；秀丽线虫；lncRNA；linc-14；linc-37；linc-83

The research about GO toxicity in c.elegans regulated by lncRNA

No:41112124 Student: Yu Gao

Supervisor: Qiuli Wu

Abstract

Background:

Long noncoding RNA(lncRNA) is a new research hotspot in the field of nucleic acids. As a type of model organism, caenorhabditis elegans could be used to research RNA, and furthermore, the specific biological function of lncRNA and its mechanism in c.elegans is not fully clear in c.elegans. Graphene oxide(GO) is a classic nanometer material, and also used to study the biosecurity of nanomaterials. Previous omics analysis showed that exposure to GO could up-regulate the expression of linc-14 but down-regulate the expression of linc-3 in c.elegans. Therefore we infer that lncRNA linc-14, linc-37 and linc-83 are resistant to GO,while linc-3 is sensitive to GO. Our project aims at further analysing and researching the toxic effects resulted from GO regulating the expression of RNA of c.elegans on the basis of omics analysis.

Objective:

The development of our topic will help to understand the biological function of lncRNA in c.elegans, and further reveal the form of GO toxicity.

Methods:

The mutants is obtained by feeding method. After synchronization treatment, mutants and wild type are treated with respectively GO treatment. And then, we test the motor behavior, ROS and survivorship eurve of control group and treatment group of c.elegans.

Result:

All of the test including survivorship eurve, motor behavior and intestinal ROS confirmed GO has a toxic effect on c.elegans, embodied in reducing life span, having an effect on movement and stimulate the intestinal fluorescent of nematodes. Life test and examination test of mutants (linc-14 RNAi, linc-37 RNAi and linc-83RNAi) show that the toxicity of GO do not have a substantial effect on them, suggested that mutants linc-14 RNAi, linc-37 RNAi and linc-83RNAi have resistance on GO in c.elegans. Subsequent intestinal ROS analysis confirms the conclusion.

Key words: Graphene oxide; caenorhabditis elegans; lncRNA; linc-14; linc-37; linc-83

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

第一章 绪论 1

1 非编码RNA（ncRNA） 1

2长链非编码RNA（lncRNA） 1

3 lncRNA的生物学功能 2

3.1 lncRNA参与调节的生物学过程 2

3.1.1 参与基因的表观遗传调控 2

3.1.2 对基因转录水平的调控 2

3.1.3 对基因转录后水平的调控 2

3.2 lncRNA作为媒介的生物学过程 3

4lncRNA的研究方法 3

5 lncRNA在秀丽线虫中的研究 4

6 展望 4

第二章 材料与方法 6

1实验材料 6

1.1 野生型、突变型秀丽线虫 6

1.2 菌种 6

1.3主要仪器 6

1.4 主要试剂及溶液 7

1.5主要试剂配制方法 7

2实验方法 8

2.1 GO的制备 8

2.2 GO的表征 8

2.3秀丽线虫的培养 8

2.4 饲喂法对秀丽线虫进行RNAi 9

2.5 秀丽线虫的同步化 9

2.6 秀丽线虫的GO暴露 9

2.7 秀丽线虫的评价体系 10

2.7.1 秀丽线虫的生存曲线 10

2.7.2 秀丽线虫的运动行为 10

2.7.3 秀丽线虫的肠道ROS 10

第三章 结果与讨论 12

1 实验结果 12

1.1 GO的理化表征 12

1.2 秀丽线虫的毒性评价 13

1.2.1 秀丽线虫的寿命测试 13

1.2.2 线虫的运动行为测试 14

1.2.3 秀丽线虫的肠道ROS分析 15

2 总结讨论 17

参考文献 18

致谢 21

第一章 绪论

近期，随着对非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）分子研究的不断深入，研究人员不断注意到ncRNA作为细胞活动的调控因子所具有的潜力^[1]。迄今为止，被发现有ncRNA的物种已经遍及古细菌、细菌和真核生物界。古细菌及细菌由于其基因组相对较小，检测到的ncRNA数量有限，而在真核生物中，ncRNA发现的数量远远超出了研究人员的想象^[2]。ncRNA根据其长度一般分为短链非编码RNA和长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）^[3]。lncRNA一度被认为是生物体的基因转录过程的副产物，然而近年来越来越多的证据表明这类分子实质上广泛地参与着基因组的调节，包括调控个体的生长发育以及细胞的增殖、分化和凋亡等生命活动^{[4, 5]}。

1 非编码RNA（ncRNA）

生物体基因组中的DNA通过转录成RNA表达和传递生物信息。根据转录产物的功能，将RNA分为编码蛋白质的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和不编码蛋白质的非编码RNA（ncRNA）^[6]。ncRNA的发现历史可以追溯到上个世纪的50年代。在当时之前，人们普遍认可的一个理论：对于一个给定的物种中的每一个生物体，其体内的每个细胞DNA含量是等值的^[7]。而到1951年，Mirsky和Ris^[8]研究证明了同一物种体内不同类型的细胞其DNA含量不同。此后历经20余年的研究，至20世纪70年代，ncRNA的发现才证实了基因组并不反映基因的数量，因为大部分的DNA是非编码的^[9]。ncRNA包括tRNA、rRNA、snRNA和microRNA等多种已知功能的RNA以及很多生物学功能未知的RNA。与mRNA相比，ncRNA并不具备典型的启动子、启动子保守区、终止密码子及开放阅读框等特性^[6]。所有ncRNA的共同之处在于都是由基因组DNA转录而来，不能继续往下翻译成蛋白质，直接以RNA分子的形式发挥其生物学作用^{[2, 10]}。

2长链非编码RNA（lncRNA）

lncRNA是指在真核生物中新发现的一类长度大于200个核苷酸，不具有长阅读框但是通常会有mRNA结构特征（帽式结构与poly A尾巴）的RNA^{[4, 9, 11]}，在细胞的生长、发育、遗传甚至肿瘤和心血管疾病的发生过程中，具有非常重要的调控作用^{[12, 13]}。通常分为5类：即正义lncRNA（sense lncRNA）、反义lncRNA（antisense lncRNA）、双向lncRNA（bidirectional lncRNA）、基因间lncRNA（intergenic lncRNA）和 基因内lncRNA（introniclncRNA） ^{[9, 14]}。lncRNA在生物体内普遍存在转录现象，但比之编码蛋白质的基因，其表达水平通常相对较低，并且其本身的表达也会受到多个调控机制的严密调节。1996年发现的人Xist基因就是一种典型的lncRNA。在女性体内，Xist基因的作用是控制两条X染色体中的一条失去活性，使其不能表达从而维持两性生物中X染色体上的基因编码的蛋白质表达量趋于一致^{[9, 15, 16]}。

3 lncRNA的生物学功能

生物学界最初认为lncRNA没有具体的生物学功能，只是在转录过程中在RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNA PⅡ）作用下产生的一种副产物，属于基因组转录的“噪音”^{[17, 18]}。随着研究的深入，不断有结果表明lncRNA具有复杂而广泛的生物学功能^{[19, 20}]，如染色质相关功能，转录以及剪接的调控等。有一类lncRNA有着转录极端保守区域（transcribed ultraconserved regions，T-UCRs），这一区域通常位于与肿瘤相关的基因片段处。尽管大量的证据表明了T-UCRs在原癌基因的表达中有着重要在作用，目前关于这一作用的机制还是少有研究企及^[21]。现在一般认为，在生物体内，lncRNA直接以RNA的形式，在表观遗传水平、转录水平以及细胞分化层次上调控基因的表达 ^[22]。此外，lncRNA还可以调控细胞周期及细胞凋亡等生命活动。

3.1 lncRNA参与调节的生物学过程

3.1.1 lncRNA参与基因的表观遗传调控

表观遗传是指在不引起基因组DNA序列变化的情况下，通过对基因的系列修饰手段实现基因表达出可遗传的变化，该现象普遍存在于动植物中，在生物体发育及肿瘤发生等过程中发挥着重要作用^[23]。目前已知的表观遗传调控方式有DNA甲基化、基因沉默、核仁显性、组蛋白修饰、基因组印迹、随机染色体失活以及RNA编辑等^{[17, 24, 25]}。lncRNA在行驶其功能时一般会受到表观遗传修饰的影响，但同时lncRNA又可以通过表观遗传调控基因的表达^[24]。在胚胎发育阶段，lncRNA通过表观遗传调控参与X染色体沉默、基因组印迹以及染色体剂量补偿效应等生命活动，对于细胞分化和胚胎发育具有重大意义^{[17, 25, 26]}。

3.1.2 lncRNA对基因转录水平的调控

生物体内的基因转录是一个受到严格调控的复杂过程。除了RNA PⅡ和一部分转录因子，现阶段已有研究表明lncRNA也参与了基因转录的调控^[23]。

lncRNA调控基因转录的方式有：lncRNA在自身转录时干扰邻近基因的表达并调控其转录；lncRNA通过与RNA PⅡ相互作用在转录过程发挥调控作用；lncRNA与DNA通过碱基互补配对形成稳定的DNA-RNA三联复合体，调节靶基因的转录。此外，研究表明lncRNA还可以通过作为转录因子的共激活因子或者内源性竞争性RNA等方式调控基因的转录^{[17, 27, 28]}。

3.1.3 lncRNA对基因转录后水平的调控

转录后水平的调控是指对基因转录后的产物进行一系列加工的过程，主要是对于RNA前体的加工、剪接、翻译及稳定性的调节等，对于基因的表达具有非常重要的作用。lncRNA可通过与mRNA形成RNA双链体等形式，从而可能对转录后的任一个环节产生影响^[28]。lncRNA对基因转录后水平的调控可以从多个方向实现，主要有：lncRNA可被剪切成非编码小RNA（small non-messenger RNA，snmRNA）行使生物学作用；lncRNA可以增加mRNA的稳定性；lncRNA调控mRNA前体的选择性剪接实现转录后的修饰；lncRNA与miRNA的相互作用，影响mRNA的转录后翻译过程等^{[17, 27]}。

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