论文总字数：39596字

摘 要

一直以来，骨科疾病都是生物医学界的研究重点与热点之一，其预防与治疗颇受关注。而针对骨科疾病治疗的关键点在于在骨缺损的基础上诱导成骨细胞的增殖与分化，通过加速骨修复的进程改善这种缺损状态。因此，对于骨修复以及相关材料的进一步研究显得尤为重要。

纳米材料由于其具有的奇异特性，包括小尺寸效应及表面或界面效应等，已经在组织修复、肿瘤治疗以及体外诱导成骨生成等应用中取得突破性进展。本实验通过制备磁性微纳基底并在此基础上培养小鼠骨髓间充质细胞，从而观察该基底磁性对成骨细胞分化的影响。

本实验采用层层自组装的方式将磁性纳米颗粒分别组装在玻片以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid）,PLGA）基底膜上，并进一步对其进行磁化，由此得到几组经过不同处理的磁性纳米基底，然后对不同材料进行相应表征。然后将材料置于24孔细胞培养板中，培养小鼠骨髓间充质干细胞，并诱导其向成骨细胞的分化。最后通过光镜观察、流式细胞仪检测、碱性磷酸酶染色、CCK8法检测细胞活力、定量PCR检测分化相关基因等方法鉴定成骨细胞的分化状况。

实验结果表明，经过自组装的磁性微纳基底对原代小鼠骨髓细胞分化的促进作用要强于自然干的基底，且经外加磁场磁化后的材料对细胞分化的促进作用更加明显。此结果可为骨修复材料的研发提供一个初步参考方向。

关键词：磁性纳米材料，成骨细胞，层层自组装

Study on the mechanism of the effects of the magnetism of magnetic micro nano basement on osteoblast

4112123 Xianhe Cao Tutor:Xuan Liu

Abstract

All along, orthopedics disease is always one of the foci and hotspots in the biomedical research field,and the prevention and treatment of this disease are quite concerned. The key point for the treatment of orthopedics disease is to induce the proliferation and differentiation of osteoblasts on the basis of bone defect, and to improve the status of this defect by accelerating the process of bone repair. Therefore,the further study of bone repair and related materials is particularly important.

Nano materials have made a breakthrough in tissue repair, tumor therapy and in vitro induction of osteogenesis and other applications due to its special properties, such as small size effect, surface or interfacial effect. In this study, we prepared the magnetic micro nano basement and cultured the mouse bone marrow mesenchymal cells,then we observed the effect of the basal magnetism on the differentiation of osteoblasts.

In this experiment,the magnetic nanoparticles were assembled on the sheet glasses and poly lactic-co-glycolic acid(PLGA) basement membrane respectively through layer by layer self-assembly method(LBL),then put the materials in external magnetic field with the intensity of 500mT to make them magnetized. Finally we got several groups of magnetic nano basements after different treatments,the characterization was followed. Then we placed those materials in the 24 hole cell culture plate. And based on that, the primary mouse bone marrow mesenchymal stem cells were cultured and induced to differentiate into osteoblasts. Finally, several methods were conducted to identify the differentiation of osteoblasts, such as optical microscope, flow cytometry, alkaline phosphatase staining, CCK8 method to detect the cell viability, quantitative PCR detection of differentiation related genes and so on.

Experimental results show that the magnetic micro nano basement after LbL self-assembly contributed more to the differentiation of primary mouse bone marrow cells than natural dry basements,and the promoting effect of those materials magnetized by applied magnetic field on the differentiation of cells is more obvious.This result can provide a preliminary reference for the research and development of bone repair materials.

Keywords: Magnetic nano material; osteoblast; LbL

目录

摘要 - 1 -

Abstract - 2 -

目录 - 4 -

第一章 绪论 - 6 -

1.1磁性纳米材料的研究进展 - 6 -

1.1.1磁性纳米材料的特性 - 6 -

1.1.2 磁性纳米材料在生物医学领域的应用 - 6 -

1.1.3 磁性微纳基底的制备 - 7 -

1.1.3.1聚乙烯醇（PVA）水凝胶微球的制备 - 7 -

1.1.3.2 PLGA基底的制备 - 9 -

1.1.3.3 磁性微纳基底的层层自组装 - 9 -

1.2成骨细胞的研究进展 - 9 -

1.2.1 成骨细胞的生物学特性 - 10 -

1.2.1.1 成骨细胞的来源 - 10 -

1.2.1.2 成骨细胞的形态 - 10 -

1.2.1.3 成骨细胞的分化调控因子 - 10 -

1.2.2成骨细胞的体外诱导分化与鉴定 - 11 -

1.2.2.1成骨细胞的体外诱导分化 - 11 -

1.2.2.2成骨细胞的鉴定 - 11 -

1.3 磁性纳米材料对成骨细胞生长分化的影响 - 12 -

1.4 小结 - 13 -

1.5 本实验研究的目的和内容 - 14 -

第二章 实验材料与方法 - 15 -

2.1实验材料与器械 - 15 -

2.1.1 实验动物 - 15 -

2.1.2 主要试剂 - 15 -

2.1.3 实验器械 - 16 -

2.2 实验方法 - 17 -

2.2.1 实验分组 - 17 -

2.2.2 材料制备 - 17 -

2.2.2.1聚乙烯醇(PVA)水凝胶微球的制备 - 17 -

2.2.2.2 MNP在玻片上的层层自组装（LbL） - 18 -

2.2.2.3 MNP在玻片上的自然干燥 - 19 -

2.2.2.4 PLGA基底的制备以及层层自组装 - 20 -

2.2.2.5 已组装玻片及PLGA基底在外磁场中的磁化 - 21 -

2.2.2.6 扫描电镜观测各组材料 - 21 -

2.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞分离与培养 - 21 -

2.2.4 成骨细胞分化鉴定 - 22 -

2.2.4.1 碱性磷酸酶（ALP）染色 - 22 -

2.2.4.2 成骨细胞Von Kossa’s钙结节染色 - 23 -

2.2.4.3 CCK8法检测细胞活力 - 23 -

2.2.4.4 定量PCR检测分化相关基因 - 23 -

2.2.4.5 流式细胞仪检测细胞周期 - 25 -

第三章 实验结果与讨论 - 26 -

3.1 PVA微球的表征 - 26 -

3.2纳米材料的表征 - 26 -

3.3 成骨细胞体外培养预实验 - 28 -

3.3.1 成骨细胞诱导分化 - 28 -

3.3.1.1 碱性磷酸酶染色 - 29 -

3.3.1.2 Von Kossa’s钙结节染色 - 29 -

3.3.2 试数培养 - 29 -

3.3.2.1 倒置显微镜下观察细胞分化情况 - 30 -

3.3.2.2 碱性磷酸酶染色鉴定细胞分化状况 - 30 -

3.4 小鼠成骨细胞与磁性微纳基底之间的相互作用 - 31 -

3.4.1 倒置显微镜下观察细胞分化情况 - 31 -

3.4.2 碱性磷酸酶染色鉴定细胞分化状况 - 32 -

3.4.3 CCK8法检测细胞活力 - 33 -

3.4.4 定量PCR检测分化相关基因 - 34 -

3.4.5 流式细胞仪检测细胞周期 - 43 -

3.5 小结 - 44 -

第四章 总结与展望 - 45 -

致谢 - 47 -

参考文献 - 48 -

第一章 绪论

1.1磁性纳米材料的研究进展

1.1.1磁性纳米材料的特性

纳米科技是20世纪80年代兴起的一门多学科综合交叉的技术科学，是以纳米（nm）为测量单位的产品的技术。

纳米材料是指具有纳米量级的超微粒构成的固体物质，并具有以下三个结构特点:①结构单元或特征维度尺寸在纳米数量级（1～100nm）；②存在大量的界面或自由表面；③各纳米单元之间存在一定的相互作用。纳米材料由于量尺效应产生的奇异特性，包括小尺寸效应及表面或界面效应等，已经受到材料科学界的广泛关注^[1]。

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