论文总字数:23158字
摘 要
近十年来,超分辨光学显微技术引起了科学家们的很大兴趣。2014年诺贝尔化学奖被授予Betzig等人,以奖励其在超分辨光学成像领域作出的突出贡献,分辨显微技术已然起了科学家们的注意。超分辨光学成像的主要优势在于突破了光学成像中的衍射极限,把传统成像分辨率提高了10~20倍。长期以来,由于衍射极限对光学显微镜的分辨率的限制,人们一直认为光学显微镜能够看清的物体的最小尺寸大约为光波长的一半。而超分辨成像技术的产生却突破了衍射极限,使分辨率高达几十纳米。在此,本论文提出了一种利用量子点作为荧光团,通过抗体抗原的特异性结合对肿瘤细胞外泌体进行荧光标记,再对外泌体进行超分辨成像的方法。这些量子点本身具有类似于绿色荧光蛋白的荧光“开”“关”闪烁特性(blink)。并且它们在单波长激光的激发下就能够实现闪烁。因此,适用于基于单分子定位技术的超分辨率光学成像(如PALM,STORM)。本文用Zeiss Elyra P.1(PALM)超分辨光学显微镜对闪烁的量子点进行数据采集,再通过数据图像处理,最后获得标记有量子点的肿瘤细胞外泌体的超分辨图像,所得图像外泌体尺寸为80nm左右,图像分辨率为25nm。关键词:量子点 肿瘤细胞外泌体 超分辨光学成像 抗体 衍射极限
Super-resolution imaging of tumor derived exosomes
Abstract: Super resolution imaging technique has received impressive attention in the last decade. The 2014 Nobel Prize in Chemistry was awarded to Betzig et al to reward their outstanding contributions in super-resolution imaging.Its main advantage is that they can break the diffraction barrier of traditional optical imaging techniques, increasing the imaging resolution by 10 to 20 times as compared with traditional optical microscopy.
For a long time,due to the diffraction barrier of optical microscopy, it is widely accepted that the minimum size of the object that can be observed by an optical microscope is about half of the wavelength of excitation light. However,the super-resolution imaging technology can break the diffraction barrier, so that the resolution could be increased to tens of nanometers.
In this paper,we present a method which is using quantum dots (QDs) as the fluorophore to label the exosomes of cancer cells,. Then super-resolution imaging microscopy is employed to image the QDs labeled exosomes. Similar to the fluorescence "on" and "off" performance of the green fluorescent protein (GFP), QDs also have a blinking property. Besides, QDs can be excited with a single laser. We use the Zeiss Elyra P.1(PALM) super-resolution optical microscope to collect the image of the blinking QDs labeled exosmes. After the data was processed to finally form a super-resolution image of the exosomes.We could find the size of the tumor derived exosomes is about 80nm and the resolution radio is 25nm.
Keywords: QDs, tumor derived exosomes, super-resolution microscopy, antibody, diffraction barrier
目 录
摘要 I
Abstract II
第一章 绪论 1
1.1 引言 1
1.2 衍射极限 1
1.2.1 光的衍射现象 1
1.2.2 衍射极限 2
1.3 突破衍射极限的超分辨光学成像 3
1.3.1 受激发射损耗(STED) 4
1.3.2 随机光学重建显微技术(STORM) 5
1.3.3 光激活定位显微镜(PALM) 6
1.4 外泌体 7
1.4.1 外泌体的组成 7
1.4.2 外泌体的形成 8
1.4.3 外泌体的研究进展 9
1.5 抗体 10
1.6 本文的研究目的和主要研究内容 10
第二章 外泌体荧光探针的制备 12
2.1 引言 12
2.2 实验仪器 12
2.3 试剂材料 12
2.4 实验方法 13
2.4.1 外泌体荧光探针的制备 13
2.4.2 检验荧光探针是否制备成功 13
2.5 实验结果与讨论 14
2.6 本章小结 17
第三章 肿瘤细胞外泌体的超分辨成像 18
3.1 引言 18
3.2 实验仪器 19
3.3 实验试剂 19
3.4 实验方法 19
3.4.1 肿瘤细胞外泌体的荧光标记 19
3.4.2 标记有探针的肿瘤细胞外泌体的超分辨成像 20
3.5 肿瘤细胞外泌体超分辨成像结果分析 21
3.6 本章小结 24
第四章 总结与展望 25
4.1 总结与展望 25
致 谢 27
参考文献 28
第一章 绪论
1.1 引言
2014年10月,美国科学家埃里克·白兹格(Eric Betzig)、威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔(William E. Moerner)和德国科学家斯特凡·W·赫尔(Stefan W. Hell)三位科学家被同时授予了诺贝尔化学奖[1,2,3],以奖励他们在超分辨光学成像领域作出的突破性贡献。
1873年,德国科学家阿贝(E. Abbe)提出了光学衍射极限[4,5]的概念,即光学显微镜所能观测到的最小尺寸约为光波长的一半,对于可见光而言,大约在200nm左右。但是,很多亚细胞结构和细胞器的尺寸都纳米级,200nm的分辨率极限使得科学家使用显微镜时只能辨别出完整的细胞及一些细胞的组成部分,而无法区分一个正常大小的病毒或者单个蛋白质,严重地阻碍了生物医学的发展。
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