论文总字数：29712字

摘 要

孤独症是一类严重的发育障碍疾病，其发病率逐年提升，引发了社会的广泛关注。目前科学界尚难以阐明孤独症的发病机制，且缺乏有效的预防和治疗措施。研究发现，果蝇中编码神经粘附分子(Neurexins和Neuroligins)的基因为孤独症相关基因，突变体果蝇表现出类似于孤独症的神经活动障碍及社会行为异常。然而，相关研究多开展于果蝇幼虫的神经肌肉接头，几乎未涉及相关基因突变对中枢神经的影响。蘑菇体是昆虫脑部的重要结构，而其中突触密集的calyx区域更是昆虫接受与处理各种感官信息的中枢，其重要性类似于鸟类的纹状体和人类大脑中的海马体。研究表明，与神经疾病相关的基因突变后，将影响calyx的神经环路，但迄今为止，所有证据大多来自光镜观察。关于calyx的精细超微结构研究，目前也只局限于野生型果蝇。

目的：以果蝇作为孤独症动物模型，探究孤独症相关基因对果蝇成虫蘑菇体calyx发育的影响，为阐明孤独症的发病机制提供初步的理论基础。

方法：对野生型和突变体果蝇的脑组织进行免疫组化和常规电镜的制样处理，分别在激光扫描共聚焦显微镜和透射电镜下观察calyx并拍照。统计相关参数并分析所得数据，说明孤独症相关基因对calyx发育的影响。

结果：编码突触前粘附分子的dnrx⁸³基因和编码突触后粘附分子的dnl2、dnl3、dnl4基因突变后，calyx的面积均会显著降低。dnl4突变体中，calyx的投射神经元末端扣结数量增加，而dnl2、dnl3突变体则使扣结面积及其突触数量增大。dnl3、dnl4突变体中，具有成熟T-bar结构的突触比例降低。此外，dnl2、dnl3、dnl4突变体的突触间隙厚度均有明显增加。

结论：孤独症相关基因突变后，将使果蝇脑部calyx变小，并会影响突触的结构与功能。

关键词：果蝇；Calyx；孤独症；Neurexins；Neuroligins；投射神经元扣结

Autism related genes regulate developmental pattern of the mushroom body calyx in adult Drosophila

Student: Zhao Tao Tutor: Gan Guangming

Abstract

Autism is a kind of serious developmental disorders that incidence rate increases year by year,causing widespread concern in the society.Up to now,the scientific community still can not clarify the pathogenesis of autism,lacking effective prevention and treatment measures.The study found that genes encoding the neural adhesion molecule (Neurexins and Neuroligins) in Drosophila are related to autism and the mutant fruit flies have neurological disorders and abnormal social behavior,similar to those with autism.However,the related studies were almost carried out in the neuromuscular junction of the fruit fly larvae,not involving the influence of the related gene mutations on the central nervous system.The mushroom body is an important structure of the insect brain,in which synaptic dense region called calyx is the center of acceptinge and processing a variety of sensory information,similar to the striatum of birds and the hippocampus of human.Studies have indicated that the gene mutations associated with neurological disorders will affect the neural circuits of calyx.However,up to now,all the evidence is mostly derived from light microscopy observation.The ultrastructural study of calyx is only limited to the wild type of Drosophila.

Objective: To explore the effects of autism related genes on the calyx development of adult Drosophila and provide a theoretical basis for elucidating the pathogenesis of autism.

Methods: The brain tissues of wild type and mutant fruit flies were treated by sample preparation procedure of immunohistochemistry and conventional electron microscope.The calyx was observed by confocal microscope and electron microscope.We measured some related parameters and analyzed statistical differences.

Results: dnrx⁸³,encoding presynaptic adhesion molecules and dnl2,dnl3,dnl4,encoding postsynaptic adhesion molecule,all significantly reduce the area of the calyx .In dnl4 mutant,the number of terminal bouton of projection neurons increases.While the dnl2 and dnl3 mutants increase the area of the bouton and the number of synapses.In dnl3 and dnl4 mutants,the proportion of synapse with mature T-bar structure decreases.In addition,the dnl2,dnl3 and dnl4 mutants have a significant increase in the synaptic cleft thickness.

Conclusion：In summary,mutations of autism related genes will make the calyx of Drosophila brain smaller and affect the structure and function of synapse.

Key words: Drosophila;Calyx;Autism;Neurexins;Neuroligins;Projection neurons bouton

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 果蝇蘑菇体及calyx区域 1

1.1.1昆虫蘑菇体的进化 1

1.1.2果蝇蘑菇体的结构 1

1.1.3果蝇calyx的结构 2

1.1.4果蝇calyx的功能 3

1.2 神经粘附分子与孤独症 3

1.2.1神经粘附分子 3

1.2.2孤独症 4

1.2.3关联 4

1.3 果蝇相关神经粘附分子 4

1.3.1 Neurexins 5

1.3.1.1 Neurexin IV 5

1.3.1.2 Neurexin-1 5

1.3.2 Neuroligins 5

1.3.2.1 NL1 5

1.3.2.2 NL2 6

1.3.2.3 NL3 6

1.3.2.4 NL4 6

1.4 展望 6

第二章 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1果蝇品系 7

2.1.2培养基 7

2.1.3实验试剂及溶液 7

2.1.4实验仪器及设备 8

2.2 实验方法 9

2.2.1果蝇的培养与解剖 9

2.2.2果蝇成虫大脑及三龄幼虫腹神经索常规电镜样品制备流程 9

2.2.3果蝇成虫大脑免疫荧光样品制备流程 10

2.2.4图像与数据分析 11

第三章 结果与分析 12

3.1 calyx的免疫组化 12

3.2 calyx的面积 13

3.3 calyx的结构 14

3.4 calyx的投射神经元扣结 15

3.4.1扣结的密度 15

3.4.2扣结的面积 16

3.5 calyx投射神经元扣结上的突触 17

3.5.1突触的密度 17

3.5.2突触的T-bar 18

3.5.3突触后树突数量 19

3.5.4突触间隙的厚度 20

3.6小结 21

致谢 22

参考文献 23

第一章 绪论

孤独症是一类严重的广泛性发育障碍代表性疾病，主要临床表现为交流沟通障碍和社会交往障碍，并伴有兴趣狭窄和刻板重复的行为方式[1]。我国约有60万学龄前孤独症儿童，约占同龄儿童总人口的千分之六，持续上升的发病率及严重的临床表现使得孤独症引发了社会的广泛关注。科学界尚难以真正阐明孤独症的发病机制，只能依靠行为学特征进行诊断，也缺乏有效的预防和治疗措施[2]。近年来，科研人员通过遗传学分析确定了一些孤独症易感基因，其中多数基因与突触发生和突触可塑性等神经发育过程相关[3]。果蝇是用于研究神经发育与神经疾病的理想模式生物，其生长周期短，繁殖力强，经济，易操作，基因相对较少。除此之外，多种信号通路在果蝇和人类之间具有高度保守性，人类基因组中含有果蝇75%致病基因的同源序列[4]。研究发现，在果蝇相关神经粘附分子（Neurexins和Neuroligins）的编码基因上引入突变，果蝇表现出类似于自闭症的神经活动障碍及社会行为异常，从而构建自闭症的果蝇模型[5,6]。然而，相关研究大多开展于果蝇幼虫，常聚焦于腹神经索（VNC）和神经肌肉接头（NMJ）处突触的结构和功能变化，几乎未涉及相关基因突变对中枢神经的影响。蘑菇体（Mushroom body）是存在于昆虫脑部的重要结构，而其中的蕈体冠（calyx）区域，主要是投射神经元和Kenyon细胞树突之间形成突触的区域，是昆虫接受与处理各种感官信息的中枢桥梁和载体，其重要性类似于鸟类的纹状体和人类大脑中的海马体。本章将对果蝇蘑菇体及其calyx区域进行描述，并以神经细胞粘附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）为切入点，综述NCAM与孤独症的联系。

1.1 果蝇蘑菇体及calyx区域

1.1.1昆虫蘑菇体的进化

昆虫的脑可依其位置划分为前脑、中脑和后脑三个部分，高级感觉中枢主要位于前脑，如中心复合体和成对存在的蘑菇体[7]。蘑菇体是存在于环节动物以及除甲壳纲以外的节肢动物中的重要神经纤维网结构，是重要的感觉整合中枢，在调节昆虫行为以适应环境变化中起着重要作用。不同种群中，蘑菇体的大小及复杂程度不同，甚至社会性昆虫各阶层间的蘑菇体形态也存在差异。结构上的差异在一定程度上反映了功能上的差异。早期的生物学家认为，正是这些差异导致节肢动物具有执行自主行为的能力，差异在一定程度上反映了各类昆虫在进化上的地位[8]。

1.1.2果蝇蘑菇体的结构

果蝇蘑菇体也称蕈形体，成对存在于前脑叶髓层中，主要由冠（calyx）、柄（pedunculus）和叶（lobes）三个部分组成（图1.1）。蘑菇体由四种不同的细胞系发育而来，各细胞系持续分化产生多种不同的神经元。通过标记可发现，不同细胞系起源的蘑菇体树突在幼虫阶段混杂在一起，而在成虫中却被限定于不同区域[9]。果蝇成虫蘑菇体主要是由2000个左右的内在神经元，即Kenyon细胞组成，根据轴突投射情况至少可分为三个亚类：α/β，α’/β’和γ。Kenyon神经元的胞体形成的神经节及爪状树突末梢参与形成蕈体冠，扮演着次级感觉中枢的角色。而Kenyon神经元的轴突则会形成蘑菇体的柄状结构，该结构会一直延伸至脑的前面，其终端则发生分支形成蘑菇体三大结构中的最后一种——叶[10]。

图1.1 果蝇成虫脑部结构示意图（标尺为100µm）

1.1.3果蝇calyx的结构

当前神经生物学的主要问题是感觉信息在更高级的脑中枢中如何表达，相关记忆如何建立。解决这两个问题的关键在于理解潜在的神经回路是如何组建的。长久以来，黑腹果蝇的蘑菇体都被认为涉及感觉相关记忆的产生与检索，且相关机制在人类与果蝇之间具有极高的保守性[11]。calyx是由蘑菇体内在神经元Kenyon细胞的树突形成的信息输入区域。嗅觉神经元接受气味分子的刺激，经其轴突将神经冲动传递给触角叶。触角叶通过内部的神经纤维球整合相关信号并借助嗅觉投射神经元将信号投射到蘑菇体的蕈体冠，与其中的Kenyon细胞树突形成突触[12]。然而，对于calyx这一重要区域，我们尚不能完全阐明其内部具体的构建情况。

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