单细胞流式电穿孔系统的研究

论文总字数：25372字

摘 要

细胞转染在基因工程、细胞生物学、临床医疗等领域有着十分重要的应用，本文提出一款集成微电极的微流体电穿孔芯片，可在单细胞层面进行高效地电转染。通过MEMS微加工工艺在玻璃基板上形成三组叉指电极和一组平行电极，利用软光刻工艺制备PDMS微流体通道层，经表面改性后，将两者永久键合，形成微体电穿孔芯片。此外，设计并制作了相应的芯片载具及外部控制电路，可实现针对不同细胞进行电穿孔参数的优化以达到最佳细胞转染效果。本课题使用海拉细胞为实验对象，使用荧光染料作为外源目标物质，细胞悬浮液流经交变电场区域时，通过细胞荧光表达证明细胞膜出现可逆性穿孔，证明实验成功实现外源分子的导入。本研究将电穿孔与微流控技术相结合，大大缩短电极间距，克服了传统电穿孔的诸多问题。

关键词：电穿孔，细胞转染，流式细胞术

Abstract

Cell transfection has a significant application in many fields, such as genetic engineering, cell biology, clinical medicine, etc. In this paper, a microfluidic chip with integrated microelectrode is proposed, which allows efficient electrotransfection at single cell level. Three set of interdigitated electrodes and one set of parallel electrodes are fabricated on the glass substrate through MEMS micromachining process, as well as a PDMS layer with microfluidic channals by a soft lithography process. After surface modification, the two parts are permanently bonded in order to form an integrated and operational chip. Additionally, in order to achieve the best cell transfection efficiency, some other accessories sections are devised to faciliate our experiment, including the matched chip pedestal for chip fixation and the peripheral control circuit for parameter optimization, as regard to different cells. In this study, HeLa cella are made as a typical experiment object, using fluorescent dyes as extracellular target substances to indicate the efficiency of experiment. That is, when the cell suspension flowed through the alternating electric field region, the reversible penetration of the cell membrane was confirmed by cell fluorescence expression. Corresponding fluorescence demonstrates that the experiment successfully realizes the transportation of exogenous molecules. This project combines electroporation with microfluidic technology. Greatly shorten the distance between the adjacent electrodes and avoid many of the conventional problems of traditional electroporation.

Keywords: electroporation, cell transfection, flow cytometry

目 录

摘要 III

Abstract IV

目 录 V

第一章 绪论 1

1.1 研究背景及现状 1

1.1.1 微流控 1

1.1.2 国内外发展现状及其应用 1

1.2 基于微流控的电转染技术 4

1.2.1 体电穿孔（Bulk Electroporation） 4

1.2.2 单细胞电穿孔（Single Cell Electroporation） 4

1.2.3 单细胞膜局部电穿孔（Localized Single Cell Electroporation） 5

1.3 论文研究内容及论文结构 7

第二章 单细胞流式电穿孔原理 9

2.1 电穿孔简介 9

2.2 电穿孔原理 9

2.2.1 跨膜电位（TMP） 9

2.2.2 可逆电穿孔和不可逆电穿孔 13

2.3 电穿孔参数 16

2.3.1 脉冲参数 16

2.3.2 细胞参数 16

2.3.3 缓冲液 16

2.4 本章小结 17

第三章 单细胞流式电穿孔系统 18

3.1 微流体电穿孔芯片加工 18

3.1.1 固化PDMS微流体通道层的制作 18

3.1.2 玻璃基板的制作 18

3.1.3 固化PDMS通道与玻璃基板键合 19

3.2 外接控制电路设计 23

3.3 本章小结 24

第四章 细胞电穿孔实验方案 26

4.1 细胞培养 26

4.1.1 细胞复苏 26

4.1.2 细胞传代 26

4.1.3 细胞悬液 26

4.2 染料选取 27

4.2.1 染色原理 27

4.3 细胞染料转染实验 27

4.3.1 染料转染方案原理 27

4.3.2 染料转染实验可行性验证 28

4.4 本章小结 31

第五章 染料细胞转染实验结果 32

5.1 转染效率分析 32

第六章 总结与展望 34

6.1 总结 34

6.2 展望 34

致 谢 35

参考文献 36

绪论

研究背景及现状

微流控

微流控（Microfluidic）是一门通过使用微米尺寸的结构，来实现对几何尺寸在亚毫米范围的微流体精确控制和操纵的学科。这是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程等领域的交叉学科，在实际应用中对微量流体进行多样化、自动化、高通量筛选，具有试剂消耗小、处理分析速度快、自动化程度高、制作成本低、体积小易于集成等特点。

微流体芯片的核心是使用一种材料（玻璃、硅、聚合物如PDMS），通过蚀刻或倒模的方法制作出的一组微通道。形成微流体芯片的微通道连接在一起以实现所需功能（混合，泵送，分选或控制生化环境）。微流体芯片的微通道网络通过芯片的输入和输出口与外部连接，由此宏观与微观建立联系。经过这些孔，液体（或气体）通过外部动力装置如压力控制器、推动式注射器，经由管道从微流体芯片注入和排除。

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