论文总字数：5061字

1.预猝灭猝灭基底的制备及研究

1.1金纳米粒子的制备

1.1.1实验材料

10%的氯金酸（HAuCl₄·3H₂O）、1%的柠檬酸三钠（Sodium citrate dihydrate,Na₃-citrate）为还原剂、去离子水、各种规格的移液枪、250ml锥形瓶、100ml量筒、磁子等

1.1.2实验步骤

金纳米粒子的制备采用的是Frens^[13]发明的经典方法。

制备粒径为15nm的金纳米粒子具体实验过程如下：取100mL的去离子水，倒入锥形瓶中，再用移液枪量取100L氯金酸注入锥形瓶中，将锥形瓶放置在加热台上，温度设置为100摄氏度，磁子搅拌转速为300r·min^-1，待溶液沸腾后在锥形瓶中迅速注入4mL 1%的柠檬酸钠水溶液，混合溶液持续沸腾30分钟后，关闭加热，保持搅拌直至溶液自然冷却至室温，最终溶胶颜色呈现酒红色。将制备好的金纳米粒子避光保存备用。

制备粒径为45nm的金纳米粒子具体实验过程与上述基本一致，只需将柠檬酸钠水溶液的用量改为1mL，并且观察最终溶胶颜色是否为棕红色。

2自组装金纳米薄膜的制备

1.2.1实验材料

提前制备好的金纳米粒子溶胶、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)高分子量聚合物、piranha溶液（食人鱼溶液）、显微镜载玻片等

1.2.2实验步骤

实验室购买的PDDA溶液的质量分数为20%，自组装金属薄膜需要的PDDA溶液的质量分数为1%，因此先取一定量的20%的PDDA溶液进行稀释。本实验采用的基片为显微镜载玻片，载玻片要先浸泡在食人鱼溶液（98%的浓硫酸和30%的双氧水的混合溶液，体积比为7：3或3：1）中过夜，待食人鱼溶液腐蚀掉载玻片上的杂质后，再用大量去离子水冲洗，最后用氩气吹干保存备用。

处理过的基片置于1%的PDDA溶液中浸泡一个小时，使基片表面带上正电荷，再用大量去离子水冲洗，最后用氩气吹干保存备用。

自组装金纳米粒子薄膜的制备就是将上述处理过的基片浸泡在金纳米粒子溶胶中过夜，第二天取出用大量去离子水冲洗，再用氩气吹干保存备用。我们利用两种不同尺寸的金纳米粒子制备了两种金纳米粒子薄膜，分别命名为Au15和Au45。

1.3实验结果及研究

1.3.1金纳米粒子的制备

一般而言，在可见光波段，金纳米粒子的荧光增强能力较弱，而往往表现出较强的荧光猝灭效应。为了获得荧光猝灭基底，我们在金纳米粒子的制备过程中，改变了还原剂柠檬酸钠的用量，而保持其他实验条件不变。所得到的金纳米粒子的TEM图和吸收光谱分别如图1.1和图1.2所示。

(b)

(a)

图1.1.不同粒径金纳米粒子透射电镜图。(a)15nm；(b)45nm

图1.2 不同粒径的金纳米粒子吸收光谱

由图1.1.a和图1.1.b可见，我们分别获得了两种不同尺寸的金纳米粒子。图1.1.a所示的金纳米粒子呈球形，直径约为15nm，且尺寸均一性较好。图1.1.b所示的金纳米粒子的形状以近似球形为主，但也存在其它形状的粒子，并且尺寸不均，大约在30~50nm之间。金纳米粒子的尺寸随着柠檬酸钠用量的增加而减小，这与此前的报导一致。

由图1.2可知，随着金纳米粒子的直径由15nm增加到45nm，金纳米粒子的吸收峰位由518nm红移至545nm。LSPR峰位随着粒子直径的增加而红移，这与LSPR理论以及前人的报导^[22]一致。上述结果表明，我们已经成功制备出了直径约为15nm和45nm的金纳米粒子。

1.4荧光猝灭效应研究

荧光猝灭效应与基底种类和荧光分子种类有关。我们采用不同基底，包括两种金纳米基底和硅基底，针对两种荧光分子，即Cy5和RB进行研究。我们在不同的基底上滴加相同密度的荧光分子，风干后进行荧光检测。我们首先使用共聚焦荧光显微镜对自组装金纳米薄膜（Au15）上的Cy5进行检测，并与载玻片上的Cy5进行比较，结果如图1.3所示：

(b)

(a)

图1.3 共聚焦荧光显微镜下Cy5荧光图（a）载玻片上的荧光强度（b）Au15上的荧光强度

经过共聚焦荧光显微镜的测量，我们可以从图1.3上明显看出自组装金纳米薄膜上的荧光强度比普通载玻片上的荧光强度弱。自组装金纳米薄膜Au15对荧光分子的猝灭效果十分明显。

图1.4所示为在Au15、Au45和载玻片三种基底上，Cy5的荧光光谱。图中绿色曲线为载玻片上Cy5的荧光光谱。载玻片对荧光光谱的影响很小，不具备荧光猝灭能力。因此该光谱可作为参考光谱。与载玻片相比，Au45上的Cy5的荧光强度有所降低，如图中红色曲线所示，表明该基底具有一定的猝灭效应。而黑色曲线所示为Au15上Cy5的荧光光谱，可见其荧光强度显著降低，表明该基底的猝灭效率较高。经估算，Au45对Cy5的猝灭效率约为31%，Au15对Cy5的猝灭效率约为71%。猝灭效率与金纳米粒子的尺寸紧密相关。根据文献报道，在金纳米粒子的消光光谱中，随着粒子尺寸的减小，散射分量的比重减小，而吸收分量的比重增加。这使得较小的金纳米粒子具有较强的荧光猝灭能力。这与我们的实验结果相一致。

图1.4 Cy5在不同基底表面上的荧光光谱

除了Cy5外，我们也针对不同基底对RB的荧光光谱的影响进行了研究，结果与Cy5的情形基本一致。不同基底对RB的荧光猝灭效率如图1.5所示。Au45基底对RB的荧光强度影响很小，而Au15基底则能够显著猝灭RB的荧光，猝灭效率约为56.6%。此外，我们还研究了硅片对RB荧光强度的影响。实验结果表明硅片能够强烈猝灭RB的荧光，猝灭效率达到98.4%。因此，硅片是一种高效的荧光预猝灭基底.

图2.5 附着了不同粒径的金纳米粒子的基底对RB的猝灭效率图

1.5基于预猝灭的荧光增强效应及研究

我们采用硅片作为荧光预猝灭基底，对基于预猝灭的荧光增强效应进行研究，结果如图1.6所示。当RB沉积在硅片上时，由于荧光猝灭效应，荧光强度较低，如图中黑色曲线所示。而把15nm金纳米粒子滴加到硅片上并风干时，荧光光谱如图中红色曲线所示。可见荧光强度获得了显著的提高，增强因子约为9.8倍。根据以往报道，荧光增强因子与金属纳米粒子的表面密度密切相关，由此可以推断，通过对金纳米粒子的表面密度进行优化，可以实现更高的荧光增强。一般而言，15nm的金纳米粒子的增强能力较弱，主要表现为猝灭效应。因此我们的实验结果表明，荧光预猝灭有助于促进荧光增强效应。

图1.6 预猝灭的RB及经以此金纳米粒子沉积后的荧光光谱。黑线：预猝灭的RB的荧光光谱；红线：经15nm金纳米粒子沉积后的荧光光谱

基于预猝灭的SEF免疫检测

2.1金纳米粒子的制备

制备直径为45nm的金纳米粒子的具体步骤如下：取100mL的去离子水，倒入锥形瓶中，再用移液枪量取100L氯金酸倒入锥形瓶中，将锥形瓶放置在加热台上，温度设置为100摄氏度，磁子搅拌转速为300r·min^-1，待溶液沸腾后迅速注入1mL 1%的柠檬酸钠水溶液，混合溶液持续沸腾30分钟后，关闭加热，保持搅拌直至溶液自然冷却至室温，最终溶胶颜色呈现酒红色。将制备好的金纳米粒子避光保存备用。

制备直径为70nm的金纳米粒子步骤与上述基本相同，只需将柠檬酸钠水溶液的用量改为600L，并且观察最终溶胶颜色为棕红色即可。

2.2金纳米粒子-抗体复合物的制备

2.2.1试剂

金纳米粒子溶胶（粒径大小为45nm、70nm）、BBS缓冲液（硼酸盐缓冲液）、0.2M碳酸钾溶液、1mg/mL GAH IgG、5% BSA溶液

2.2.2实验步骤

两种尺寸的金纳米粒子-抗体复合物（Gold-Antibody Nanocomposite, GANC）采用如下方法制备：分别量取粒径大小为45nm和70nm的金胶各5mL，离心20分钟，去除上清液。将沉淀物溶解在1mL BBS缓冲液中。通过超声振荡使粒子均匀分散，再加入一定量的浓度为0.2M的K₂CO₃调节溶液的PH至9.0。再加入70L,1mg/mL的GAH IgG，置于摇床中在37℃下振荡1h，然后加入24L,5%的BSA溶液，继续振荡0.5h。振荡完毕后，取出离心提纯两次，最后溶解于200L BBS溶液中，在4℃下保存备用。将这两种尺寸的金纳米粒子-抗体复合物分别命名为GANC45和GANC70。

2.3免疫检测预猝灭基底的制备

2.3.1实验步骤

荧光预猝灭免疫基底的制备步骤如下：

1）硅片清洗。将硅片放置在食人鱼溶液中，在60摄氏度下浸泡4个小时。取出后用大量去离子水反复冲洗，再用氩气吹干并保存备用。

2）硅片表面处理。将清洗干净的硅片浸泡在质量分数为1% PEI水溶液中，浸泡60 分钟。取出后用大量去离子水反复冲洗，再用氩气吹干并保存。

3）在1 mL 100 M的RB水溶液中加入10 L新配的浓度为 10 mM的EDC水溶液和2.5 L 浓度为0.1 M的NHS水溶液，放置于摇床中，在室温下振荡反应15 min，然后用PBS稀释RB浓度至10 M，取100 L该混合溶液滴加在经过PEI修饰的硅片的圆孔中，在37℃下避光静置1 h。取出载玻片，用大量去离子水反复冲洗，再用氮气吹干，最终得到荧光预猝灭基底。

4）将100 L，5%的GA水溶液滴加到按上述方法制得的荧光预猝灭基底上，在室温下静置3 h，然后用大量去离子水冲洗，氮气吹干，即得到荧光预猝灭免疫基底。

2.3.2免疫检测步骤

将1 g/mL的人IgG和BSA分别滴加到两个荧光预猝灭免疫基底上，放置于65%～75% 湿盒中，在4℃下过夜培育。将培育过后的基底取出，依次用TBS-T、TBS和去离子水反复冲洗，再用氩气吹干。将5%的BSA溶液滴加到基底上，在室温下封闭静置3 h，之后取出用TBS-T和去离子水清洗，再用氩气吹干。然后将50 L的GANC溶液滴加到基底上，在37℃下培育1 h，用TBS-T、TBS和去离子水反复清洗，用氩气小心吹干，测量荧光光谱以对特异性进行表征。

2.4实验结果及讨论

金纳米粒子的散射截面随着尺寸的增加而增大，因此较大尺寸的金纳米粒子具备较强的荧光增强能力。我们制备了45nm和70nm的金纳米粒子，用于抗体的连接以及荧光免疫检测的研究。45nm的金纳米粒子如第二章中图2.1.b所示。70nm的金纳米粒子如图2.2所示，可见尺寸和形貌较为不均。其消光光谱如图2.3所示，LSPR峰位在550nm，与文献报道相一致。当两种金纳米粒子与GAH IgG相结合后，分别形成两种不同尺寸的复合粒子GANC45和GANC70，其成功制备可由后续免疫效果验证。

图2.2 粒径为70nm的金纳米粒子透射电镜图

图2.3 粒径为70nm的金纳米粒子吸收光谱

荧光预猝灭基底需要兼具荧光预猝灭特性和蛋白质分子固定能力。我们首先用PEI对硅片表面进行修饰，使硅片表面带有氨基，接着利用EDC/NHS偶联法将RB分子中的羧基和硅片表面的氨基相连，从而将RB分子固定在硅片表面。由第二章内容可知，硅片能够显著猝灭RB的荧光。另外，通过使剩余的氨基与戊二醛发生反应，使得基底具备蛋白质分子固定能力。通过将IgG或者BSA固定在基底上，我们成功制备了荧光预猝灭免疫基底。其荧光光谱如图2.4中黑线所示。

图2.4 预猝灭免疫基底上采用不同粒径GANC进行免疫反应后的荧光光谱

当GANC与预猝灭荧光免疫基底相接触时，在适当的温度和湿度条件下，GANC中的GAH IgG抗体将与基底表面的人IgG发生特异性结合，因此GANC将被固定在基底表面。金纳米粒子因而接近RB分子，并将预猝灭的RB分子的荧光重新增强。当免疫基底上固定BSA时，GANC与BSA不存在特异性结合作用，因此基底表面沉积的GANC粒子极少。而当免疫基底上固定人IgG时，两种GANC粒子都具有较多的表面沉积量，这表明免疫反应已经发生，由此可以证明，我们所制备的GANC粒子具有与人IgG发生特异性结合的能力。

当采用GANC45时，荧光强度只有微弱的增强，如图3.4中红色曲线所示。此时增强因子约为1.5倍。当采用GANC70时，荧光强度得到显著的增强，如图3.4中绿色曲线所示。此时增强因子约为6倍。可见相比于较小尺寸（45nm）的金纳米粒子，较大尺寸（70nm）的金纳米粒子表现出更强的荧光增强能力。这一显著的荧光增强将有助于对人抗原的浓度进行定量检测。

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