摘 要

本文探讨了用于超分辨光学显微技术的金属-染料型超分辨光学成像探针的制备，并且利用单分子定位成像技术（SMLM）分析了探针的成像定位精度。科学家们在探索医学、生物等学科时需要用到高精度的显微镜，但是传统的光学显微镜受限于衍射极限，分辨率只能达到200-300nm，已经无法提供更多的帮助。科学家们研发了许多突破衍射极限的新型显微技术，单分子定位成像技术（SMLM）就是其中精度最高的之一，而要实现SMLM成像，构建出能够满足其成像需求的特殊光学探针是首要任务。本文就分析了一种金属-染料型探针的制备方法，先在金球（或银球）上包一层二氧化硅，然后用APTMS偶联Alexa 647-NHS ester 染料和包好硅的金球。制备成功金属-染料型超分辨光学成像探针之后，利用Zeiss Elyra P.1型超分辨光学显微镜观察其闪烁特性，分析成像定位精度。利用控制包硅过程的反应时间来控制二氧化硅的厚度，研究其与成像定位精度之间的关系。这种金属-染料型探针由于其闪烁特性，在医学，尤其是癌细胞的研究方面有着非常广阔的前景。

关键词：金属-染料，SMLM，二氧化硅纳米粒子的闪烁，定位精度

Abstract

This article discusses the preparation of metal-dye super-resolution optical imaging probes for super-resolution optical microscopy, and uses single-molecule alignment imaging (SMLM) to analyze the positioning accuracy of the probes. Scientists need to use high-precision microscopes in the exploration of medicine, biology and other disciplines, but traditional optical microscopes are limited by the diffraction limit. They have not been able to provide more help because the resolution can only reach 200-300nm. Scientists have developed many new microscopic techniques that break the diffraction limit. SMLM is one of the most accurate ones. To achieve SMLM imaging, the first and foremost task is to construct special optical probes that can meet their imaging needs. This article analyzed the preparation of a metal-dye type probe by first coating a gold sphere (or silver sphere) with silica and then coupling the Alexa 647-NHS ester dye and the silicon-encapsulated gold ball with APTMS. After successfully preparing the metal-dye type super resolution optical imaging probe, the scintillation characteristics were observed using a Zeiss Elyra P.1 super resolution optical microscope, and the imaging positioning accuracy was analyzed. The silicon dioxide thickness was controlled by controlling the reaction time of the silicon coating process, and its relationship with the imaging positioning accuracy was studied. Due to its scintillation characteristics, this metal-dye probe has a very broad prospect in the research of medicine, especially cancer cells.

KEY WORDS: metal-dye, SMLM, scintillation characteristics of NPs, positioning accuracy

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 引言 1

1.2 光的衍射 2

1.2.1 衍射 2

1.2.2 衍射极限 2

1.3 超分辨率光学显微技术 3

1.3.1 结构光照明显微技术（SIM） 3

1.3.2 受激辐射损耗显微技术（STED） 4

1.3.3 单分子定位成像技术（SMLM） 4

1.3.4 单分子定位显微技术（SMLM）的具体应用 5

1.4 荧光成像 5

1.4.1 区分荧光分子的不同构象/能态 5

1.4.2 荧光分子闪烁的不同周期 6

1.4.3 荧光分子的极性/朝向不同 6

1.5 本文的研究目的和主要研究内容 6

第二章 超分辨成像探针的制备 7

2.1 引言 7

2.2 实验仪器及试剂材料 7

2.3 金胶实验过程 7

2.3.1 制备金胶 7

2.3.2 制备金胶失败分析 8

2.3.3 检测金胶是否烧制成功 8

2.3.4 制备AuNP@SiO2纳米粒子（方法一） 9

2.3.5 制备AuNP@SiO2纳米粒子（方法二） 10

2.3.6 检测AuNP@SiO2纳米颗粒的光学性质 11

2.3.7 包硅失败分析 11

2.3.8 解决办法 12

2.4 银胶实验过程 12

2.4.1 制备银胶 12

2.4.2 制备AgNP@SiO2纳米粒子 13

2.4.3 在AgNP@SiO2纳米粒子上偶联Alexa647染料 13

2.5 实验过程的原理说明 14

2.5.1 APTMS的作用 14

2.5.2 制备AgNP@SiO2-Alexa-647 14

2.6 本章小结 15

第三章 成像定位精度的研究 16

3.1 引言 16

3.2 实验仪器及试剂 16

3.3 测试前期准备 16

3.4 成像实验（一） 17

3.4.1 闪烁测试 17

3.4.2 定位精度分析 18

3.4.3 第一次成像实验分析 20

3.5 成像实验（二） 20

3.5.1 闪烁测试 20

3.5.2 定位精度分析 21

3.5.3 第二次成像实验分析 23

3.6 本章小结 23

第四章 总结与展望 24

致 谢 25

参考文献 26

绪论

引言

很长一段时间以来，凭借着无损伤、非接触、可探测样品内部等优点，生命、材料等学科一直采用远场光学显微镜作为最常用的观测工具。但是，作为一种电磁波，光具有衍射特性和干涉特性。对于可见光，德国科学家恩斯特·阿贝提出了“阿贝极限”的概念，即“传统光学显微镜的分辨率的极限约为可见光波长的一半，即200nm左右”^[1]。在衍射极限临界点，显微镜的分辨率不会再随着物镜的放大倍率的提高而提高。

为了研究分子尺度的细微结构，如细胞、病毒等（如图1-1）的动态和结构特征^[2]，科学家们需要提高光学显微镜分辨率，这就必须突破光学衍射极限。近十年来，多种能够突破衍射极限的光学成像技术已经被研发出来，如受激辐射损耗显微技术（STED），结构光照明显微技术（SIM），单分子定位成像技术（SMLM）等。^[3,5,6]