论文总字数：22852字

摘 要

本文研究了一种新型的基于表面增强拉曼散射技术的外泌体检测方法，利用“捕获磁球—外泌体—SERS探针”的三明治结构来实现快速、高灵敏度的检测。

三明治结构的实现基于生物特异性识别原理，利用anti-CD63、anti-CD81抗体与肿瘤细胞外泌体表面抗原的特异性结合反应，捕获磁球和SERS探针可以与外泌体稳定连接，为后续的实验分离和检测打下基础。在实验的分离提纯步骤中，利用磁球与磁铁的吸引力，快速、方便地提取出“磁球—外泌体—SERS探针”的三明治结构，省去了以往复杂的离心分离步骤。在外泌体检测环节，设置空白对照组，并根据不同外泌体溶液浓度设置实验组，随后利用共聚焦显微镜对各组混合溶液进行拉曼信号检测。最终，得到了结论：随着各组溶液中外泌体浓度下降，其对应的平均拉曼散射信号强度单调减弱。据此结论，根据溶液的平均拉曼散射信号强度变化便可以实现对肿瘤细胞外泌体的检测，并可应用到生物医学等领域。该检测方法仍存在不足之处例如：样品的存储时间太短，必须在检测时现配现用，否则检测试剂容易变质而失去活性；目前还没有实现定量分析外泌体的浓度。因此，这种检测方法仍有待研究人员的进一步改进。

关键词：外泌体、特异性识别、磁性纳米球、SERS探针

TUMOR CELL EXOSOMES DETECTION USING SURFACE ENHANCED RAMAN SCATTERING

Abstract

This thesis shows a study on a new way of detecting exosomes from tumor cells which is based on surface-enhanced Raman scattering (SERS). This detection technique is fast and has a high sensitivity. Exosome detection is achieved by a sandwich structure which is formed by magnetic nanobeads, SERS probes and exosomes.

This sandwich structure is based on immune recognition, taking advantage of the specific reaction between antibodies (anti-CD63 and anti-CD81) and antigens that are presented on the surface of exosomes. Due to the immune recognition, magnetic nanobeads and SERS probes can be linked to the exosomes, laying a foundation for the following experiments. In the separation process, sandwich structure can be extracted quickly and easily with the help of an external magnet, which avoids complicated separation steps. In the detection process, blank control groups and experimental groups with different exosome concentrations are set. Then, confocal microscopy is used to detect the SERS signals of all the groups. In conclusion, with the decline of exosomes concentration, SERS intensities of the experimental groups decrease as well. Therefore, detection of tumor cell exosomes can be achieved by detecting the intensity of SERS signals. The presented method can have a fine potential in biomedical field. However, it still has some shortcomings. For example, the sample storage time is too short which means sample needs to be produced during the detection otherwise it will go bad. Besides, this detection can not achieve quantitative analysis for now. Therefore, this detection method needs to be improved by researchers.

KEY WORDS: exosomes, immune recognition, magnetic nanobeads , SERS probes

目 录

摘 要 - 2 -

Abstract - 3 -

目 录 - 4 -

第一章 绪 论 - 6 -

1.1引言 - 6 -

1.2外泌体简介 - 6 -

1.2.1外泌体的发现与定义 - 6 -

1.2.2外泌体的结构与作用 - 7 -

1.2.3外泌体常用提取检测方法 - 8 -

1.3表面增强拉曼散射 - 9 -

1.3.1 拉曼散射 - 9 -

1.3.2 表面增强拉曼散射 - 10 -

1.3.3 表面增强拉曼散射的增强机理 - 10 -

1.3.4 表面增强拉曼散射的应用 - 11 -

1.4本文研究简介 - 11 -

1.4.1 研究目的 - 11 -

1.4.2 研究创新点 - 12 -

1.4.3 研究中的问题及解决办法 - 12 -

第二章 制备捕获磁球 - 13 -

2.1 实验目标 - 13 -

2.2 实验步骤 - 13 -

2.2.1 制备四氧化三铁纳米粒子 - 14 -

2.2.2 生成二氧化硅壳层 - 14 -

2.2.3 硅层表面修饰抗体 - 14 -

2.3 小结 - 15 -

第三章 制备SERS探针 - 17 -

3.1 实验目标 - 17 -

3.2 实验步骤 - 18 -

3.2.1 制备SERS探针内核 - 18 -

3.2.2 生成二氧化硅壳层 - 18 -

3.2.3 硅层表面修饰抗体 - 19 -

3.3 小结 - 19 -

第四章 外泌体检测 - 21 -

4.1 检测原理 - 21 -

4.2 对照实验 - 22 -

4.2.1实验步骤 - 22 -

4.2.2实验数据 - 23 -

4.2.3实验小结 - 23 -

4.3 不同浓度外泌体检测实验 - 24 -

4.3.1实验步骤 - 24 -

4.3.2 实验数据 - 24 -

4.3.3 实验小结 - 26 -

结论与思考 - 28 -

参考文献 - 29 -

致谢 - 29 -

1. 绪 论

1.1引言

随着社会的不停发展，生活质量的不断提高，越来越多的人对健康方面的知识更加关注。然而，各种各样让人谈虎色变的疾病却在时刻困扰着我们，癌症就是其中之一。在癌症的晚期，病人常常会发生肿瘤细胞的转移，最终导致死亡，这也是癌症致死的最主要原因。根据研究人员的发现，肿瘤细胞在病人体内转移的介质主要是血液循环系统。最近人们还发现，肿瘤细胞释放的一种物质——外泌体，也可以导致癌症的转移，其中往往含有许多的致癌蛋白质和RNA，会刺激正常细胞发生癌变，所以肿瘤细胞产生的外泌体密切的影响着肿瘤细胞的生长和转移^【1】。但是凡事具有两面性，外泌体看似危害巨大，但其实它也可以被用来造福于人类，例如:通过监测外泌体的分泌和变化，我们可以及时的发现病变部位，对症下药，所以肿瘤细胞外泌体检测技术对癌症的前期诊断是十分重要的。因此，本文研究了一种基于表面增强拉曼散射的外泌体浓度表征方法，利用SERS信号强度表征外泌体浓度大小，实现对外泌体的检测。

1.2外泌体简介

1.2.1外泌体的发现与定义

外泌体又常常被称为外来体。在1981年，Eberhard G. Trams和R.M. Johnstone研究从细胞中分泌出的小泡时第一次提出了这个名词。在那之后，科学家通过研究网织红细胞多泡体，终于发现了外泌体^【2】。但是在最初的研究中，人们认为外泌体只是一种可有可无的东西，作用仅仅是排出细胞成长阶段细胞膜和细胞质中的代谢物“垃圾”，所以在发现了外泌体之后的10多年里，它并没有引起科学家的重视^【3】。直到1996年，在G. Raposo的研究成果中，人体B淋巴细胞可以通过分泌外泌体来传递抗原，完成细胞免疫^【4】。并且1998年L. Zitvogel研究发现作为抗原呈递细胞的树突状细胞也可以通过分泌外泌体来实现抗原的传递，至此，外泌体终于引起了科学家的关注，人们意识到这些研究很可能证明了一点：外泌体有可能参与了细胞与细胞之间的物质交流。随后，人们又发现外泌体还含有RNA，这表明细胞能够通过分泌外泌体来影响另外的细胞，甚至影响其他细胞内的遗传物质。

外泌体实质上是直径大约为40-100nm的由细胞从细胞质中吐出的小囊泡，与之相似的是另一种从细胞内释放出的小囊泡——微泡，两者的结构和释放机理不同，且微泡通常更大，直径大约100-1000nm不等。从释放机理来看，微泡是借助于细胞膜的流动性，由细胞膜向外分离形成的小囊泡。与之对应的外泌体则是形成于细胞内的多泡体，进入初级内体之后再由分裂出的多泡体内体运输到细胞膜附近，多泡体内体表面膜通过与细胞膜融合从而把外泌体释放到细胞外。

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