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第一章 引 言

1.1 实验基本介绍

1.1.1 实验设计背景

近年来，由于社会的不断进步和发展，我们生活中的肝脏疾病发病率也随之增加，肝病影响着人类健康。而中国是肝病影响最大，发病率最高的国家，根据《病理学杂志》的报告，我国约有4亿人患有各种肝病，包括乙型肝炎，丙型肝炎，肝硬化，肝癌，非酒精性脂肪肝，酒精性肝病和药物性肝损伤。在中国，每年约有40万新的肝病病例产生，死亡人数高达30万。男性的发病率和死亡率通常比女性高，在城市地区肝病发病率和死亡率略高于农村地区^[1]。虽然居民的饮食习惯已有所改变，新生儿出生后也已接种乙型肝炎疫苗，有效降低了肝脏疾病的发生率。但是，由于我国人口数量很多和严重的老龄化问题，未来患肝病的数量还是会大概率增加，越来越多的人会去医院检查自己是否患有肝病，而人们经过繁琐的检测项目后医生才能得出结论，在这过程中，不仅医院需要消耗很多人力物力，而且被检测者在检测过程中也会出现不适的情况。针对医院人力物力消耗问题、被检测者在检测过程中出现不适问题，科研人员研究出了体外诊断试剂（简称IVD），其主要是检测人体外部样本，是从体液，血液和组织中获取信息的医疗器械。体外诊断试剂具有方便，灵活，高效的特点，其对疾病的预防，诊断，治疗，对基因和疾病的安全性评估，预后的安全性评估起到非常重要的作用，是连接医师与患者之间沟通的纽带。

但是医院在使用体外诊断试剂检测病人样本时，由于样本本身或在采血、预处理、用药过程中，存在胆红素、血红蛋白、维生素C等干扰物质，它们往往会影响到肝病样品的检测，导致检测结果偏离正常值，进而影响到医生对检测结果的判断^[2]。

1.1.2 抗干扰实验意义

就目前来说，使用体外诊断试剂盒时，可能会受到多种因素的影响，包括内源性干扰（胆红素、血红蛋白、维生素C、甘油三酯等）。内源性干扰会导致诊断信息出错，从而导致误诊或不必要的检查与治疗^[3]。对于生产商来说，生产出体外诊断试剂的抗干扰能力较强的试剂，避免内源性干扰物质影响检测结果成为他们当前需要解决的一大问题。而本次干扰实验的实验意义在于验证肝脏疾病类检测试剂盒的抗干扰能力。

1.1.3 实验方法

干扰实验主要是考察不同类型和浓度的干扰物质对检测结果有多大的影响。即通过向样品中添加不同类型和浓度梯度的干扰血清，根据统计学处理数据与其技术要求比对来判断该干扰物质对试剂的影响效果。如果是血液样本，通常考虑胆红素，甘油三酯，溶血和维生素C等物质的影响^[4]。

本实验采用添加干扰物质的方法进行干扰试验，即在样品中添加不同浓度梯度的干扰物质对试剂进行测定和评价。肝病检测试剂盒干扰物质的选择和制备是实验过程中最重要的问题。结合实验室的实际情况，最终选择胆红素，血红蛋白和维生素C作为干扰物质，制备出不同浓度梯度的干扰溶液^[5]。

第二章 实验仪器与原料

2.1 实验仪器

表2.1 实验仪器

日立7180生化分析仪是一款独立的多通道分析仪，可通过添加样品，试剂添加，混合，孵育，测光，清洗等操作来执行多个样品以及多个对象的检测，能够连续监测反应溶液的吸光度变化^[5]。其测量原理是:根据朗伯比尔定律，单色光透过一定厚度的溶液后，得到的吸光度与溶液的浓度成正比，其关系为:。式中A为吸光度；T为透光度；K为吸收系数；l为吸收介质的厚度；c为吸光物质的浓度。

2.2 实验原料

表2.2 实验原料

注：下文中出现的试剂名称均用英文缩写。

2.2.1 试剂

AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、PA试剂均是肝脏疾病类检测试剂盒，通过检测其在肝细胞中的酶活性或含量，进而反映出样本是否患有肝病情况。

2.2.2 胆红素

表2.4 胆红素理化性质

图2.1 胆红素结构式

临床意义：是医生用来判断黄疸的重要依据，也是体现肝功能是否正常的重要指标^[6]。胆红素能溶于苯、氯仿、乙醇、酸和碱，不溶于水。在碱性溶液中或遇三价铁离子则不稳定，易氧化成胆绿素。在本实验中作为干扰物质使用。

2.2.3 血红蛋白

表2.5 血红蛋白理化性质

图2.2 血红蛋白结构式

临床意义：血红蛋白是一种特殊的蛋白质，可在红细胞中携带氧气。血红蛋白的增加和减少可近似表明红细胞的增加与减少^[6]。在本实验中作为干扰物质原料使用。

2.2.4 维生素C

表2.6 维生素C理化性质

图2.3 维生素C结构式

临床意义：维生素C适用于预防以及治疗坏血症，也可用于各种急慢性传染疾病，过敏性疾病等^[6]。在本实验中作为干扰物质原料使用。 

2.2.5 碳酸氢钠

表2.7 碳酸氢钠理化性质

图2.4 碳酸氢钠结构式

用途：碳酸氢钠是通过中和强碱和弱酸形成的盐。溶于水时呈弱碱性。在制药工业中被用作抗酸剂的原料。在本实验中作为胆红素溶解剂使用。 

2.2.6 无水乙醇

表2.8无水乙醇理化性质

表2.8 （续）

图2.5 无水乙醇结构式

用途：无水乙醇是主要溶剂，通常用于制药，建筑涂料，日用品，护肤品，植物油等各个领域，占酒精总消耗量的50％以上，在本实验中作为胆红素溶解剂使用。

2.2.7 校准品

校准品是在校准功能中使用标准材料作为自变量值的标准物质。它具有固定值和已知的测量不确定度。其目的是校准特定试剂的测量系统，以便建立其特有的测量标准^[7]。

简而言之，校准品是一种或多种已知浓度的样品，作为测试中的一种或多种参考物质，因此可以通过比较其他样品的浓度来获得所有后续测试。校准品用作试剂的标准品，务必确保其准确性以及稳定性。一旦标准出现问题，后果将变得非常严重，势必会影响到后续的检测结果。如果标准液的实际浓度在一定时间内降低，则校准后的测量值会有一定程度的增加。相反，随着标准液的实际浓度增加，测量值反而会有所减小^[7]。

2.2.8 质控品

质控品是具有固定值和非固定值的材料，通常用于体外诊断试剂质控过程中使用的材料。其目的是评估或确认试剂质量的准确性，可通过能力测试或者实验室质量控制操作来实现该目的^[8]。

第三章 试剂配制方法记录

3.1 配制方法

本实验采用添加干扰物质的方法进行干扰试验，即在样品中添加不同浓度梯度的干扰物质进行测定和评价。肝病检测试剂盒干扰溶液的选择和制备是实验过程中最重要的问题。结合实验室的实际情况，最终选择胆红素，血红蛋白和维生素C作为干扰物质，制备出不同浓度梯度的干扰液。

3.2 制备方案 

3.2.1 配制干扰溶液

表3.1 干扰溶液配制步骤

补充说明：由于将不同浓度梯度的干扰溶液与空白血清以1：9的比例混合（相当于稀释十倍的干扰血清的浓度），因此在本实验中，制备胆红素，血红蛋白和维生素C的母液浓度全部相应地增加了十倍^[9-11]。胆红素、血红蛋白、维生素C母液配制详情见表3.2-3.4。

表3.2 血红蛋白母液配制表

表3.3 维生素C母液配制表

表3.4 胆红素母液配制表

3.2.2 不同浓度梯度干扰溶液

将母液稀释至50％：25％：12.5％：6.25％：3.125％（使用纯化水），见表3.5。首先将200μL纯化水添加到5个样品杯中，并根据从低到高的浓度标记样本杯2-6（例如，2号样本杯的浓度为3.125％），将200μL的原液添加到6号样本杯中，用移液枪混合，然后从6号杯中加入200μL的混合溶液至倒入5号杯子并搅拌均匀，以此类推，直到将其添加到最后一个样品杯中为止，然后使用移液枪将200μL的原液移入一个空的样本杯（标记7）中。至此，完成了不同浓度梯度的干扰溶液的制备^[11]。

表3.5 干扰溶液不同浓度梯度

3.2.3 样品制备

采集经过正常医学检查的血液样本后，肉眼可见的溶血，血脂和黄疸状态均未见的健康人血清。

补充：所取样的血清属于20-60岁不同年龄段的健康人的血清。

3.2.4 干扰血清的配制

通过向6个样品中加入450μL空血清和50μL具有不同浓度梯度的干扰溶液来制备6种具有不同浓度梯度的干扰血清。（注意：准备一个样本杯标记1，杯中加入450μL正常血清 50μL蒸馏水，不需要加任何干扰物质）^[12]。

3.2.5 检测方法

①开始实验之前，务必仔细检查生化分析仪的产品参数，选择与产品对应的校准品，并校准所有项目（即定标），然后测量每种试剂的质量控制以确定数据以及计算相对偏差。

②考虑到试剂的交叉污染问题，解决方案是合理设置这些项目的顺序，即ALT，AST，TBIL，DBIL，ALP，PA^[13]。

③试剂检测到空白血清，形成空白对照。

④根据浓度的不同，从低到高检测干扰血清样本中胆红素，血红蛋白和维生素C。

第四章 实验方案数据记录

4.1 多点定标和一点定标

校准试剂时，可以通过选择浓度梯度固定的一种或多种标准溶液来标准化标准曲线的趋势，从而获得吸光度和浓度之间的函数关系。多点校准通常用于非线性的校准，标准的“曲线”通常是抛物线的线性函数。此函数是一条简单的直线：y（浓度）= AX（吸光度） B^[14]。

实验步骤：根据试剂的位置放置每种试剂，然后扫描试剂的位置，将校准品放在校准盘上的相应位置，选择要校准的试剂，然后开始校准。定标结果见表4.1-4.6。

表4.1 ALP定标结果

表4.2 DBIL定标结果

表4.3 ALT定标结果

表4.4 AST定标结果

表4.5 TBIL定标结果

表4.6 PA定标结果

判断标准：试剂定标结果是否合理，取决于试剂的空白吸光度、空白吸光度变化率、分析灵敏度是否都在其技术要求所规定的范围之内。

4.2 空白吸光度

试剂在其特定波长下，光通过以生理盐水或蒸馏水为空白液时所测得的吸光度值。企业在实际的研发过程中，一般使用蒸馏水或生理盐水作为空白液，有的使用含牛血清白蛋白的缓冲液，而血清，血浆或尿液通常被用于临床测试^[15]。针对空白液的具体选择，主要取决于不同试剂的反应特性和测试样品的基质效应。

实验步骤：将空白液放到校准盘里，选好要测试的相应试剂，确认参数无误后，开始测试，测试结果即试剂空白吸光度见表4.7。

表4.7 空白吸光度

结论：经过实验数据与判定标准对比，ALP、DBIL、ALT、AST、TBIL、PA试剂的空白吸光度均在合理范围内。

4.3 空白吸光度变化率

空白吸光度的差值与时间之间的比值即吸光度变化率。实验步骤：将空白样品放到校准盘，设置好参数，选好要测试的相应试剂，确认参数无误后，开始测试，记录测试启动时的吸光度（A1）和约5min（t）后的吸光度（A2），然后根据（4.1）公式计算试剂空白吸光度变化率。结果如表4.8。

表4.8 空白吸光度变化率

结论：经过实验数据与判定标准对比，ALP、DBIL、ALT、AST、TBIL、PA试剂空白吸光度变化率均在合理范围内。

补充说明：一般来说，每个试剂均有空白吸光度变化率，但是试剂按照产品的技术要求，有的试剂则没有其空白吸光度变化率。

4.4 分析灵敏度

灵敏度是指试剂测试n个单位的被测物时的吸光度差或吸光度变化率。测试样品的选择影响到试剂分析灵敏度的确定和评估。样品的所以选择应更接近临床实践应用^[13]。建议使用接近于一般参考值的样品或具有较高病理学值的样品，分析灵敏度是试剂能够准确地检测出没有（无误报）的被测物质的能力。

实验步骤：取一高值校准物稀释至产品技术要求上相对应的浓度作为样品测定试剂，检测10次，测得吸光度变化即分析灵敏度。试剂的分析灵敏度如表4.9。

表4.9 分析灵敏度

结论：经过实验数据与判定标准对比，ALP、DBIL、ALT、AST、TBIL、PA试剂分析灵敏度均在在合理范围内。

综上空白吸光度、空白吸光度变化率、分析灵敏度的数据，参与实验的ALP、DBIL、ALT、AST、TBIL、PA试剂的定标数据均在合理范围之内，即可开展以下实验。

4.5 相对偏差

准确度是评估产品质量的最重要指标，相对偏差是首选方法。这种方法需要对样品进行高质量评估。通常使用标准材料或套件产品来计算相对偏差。相对偏差通常不超过±10％。检测试剂相对偏差计算公式如（4.2）。如果有国家标准和参考文件，需要按照国家标准和参考文件进行测试和评估。在实际的研发过程中，建议参考国家标准和参考材料以外的其他方法，因为参考材料或参考材料的含义不同^[14] 。试剂质控结果见表4.10。

实验步骤：将质控品放到样品盘，设置好重复检测次数，然后对试剂进行测试，取测试结果的均值（M），按公式（4.2）计算相对偏差B。式中：B表示测量结果的均值，T表示试剂-质控品相对应靶值。

表4.10 试剂质控结果

判定标准：相对偏差在±10%以内为在控。

结论：由上述表格数据可知，参与实验的ALP、DBIL、ALT、AST、TBIL、PA试剂相对偏差均在范围内。

4.6 样本数据

干扰判断：干扰值落在基础样本的±1.96S范围内(95%可信区间内)为无显著干扰。根据以下依据以及公式对样本数据进行统计学处理和分析，见公式（4.3）-（4.5）。

4.6.1 胆红素溶液干扰试验

实验步骤：根据胆红素配制方案配制不同浓度梯度的干扰血清样品，根据浓度将7个样品放入样品盘中，在电脑上选择好位置、检测项目以及检测次数，检查无误后开始检测。产品检测原始数据见附录1、产品统计学处理见表4.11-4.16。

表4.11 ALP统计学处理

判定标准：ALP样本中胆红素浓度lt;684μmol/L不会显著干扰检测结果^[16]。

结论：统计数据和判定标准的比较表明，如果ALP试剂盒检测到的胆红素浓度小于342μmol/ L的样品，则结果基本上没有明显的干扰。

表4.12 PA统计学处理

判定标准：PA样本中胆红素浓度lt;200mg/dL（3.42μmol/L）不会显著干扰检测结果。

结论：统计数据和判定标准的比较表明，PA试剂盒检测到的胆红素浓度lt;10.6875μmol/L的样本时，则结果基本上没有明显的干扰。

表4.13 DBIL统计学处理

判定标准：DBIL样本中胆红素浓度lt;0.0μmol/L不会显著干扰测试结果。

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