论文总字数：15909字

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摘要 1

关键词： 1

1.前言 3

1.1研究背景 3

1.2研究现状 3

2.淡水圈微生物的生态效应 4

2.1淡水圈微生物参与地球生物元素（碳氮硫等）化学循环 4

2.2微生物在水产养殖业中的应用 5

2.2.1饲料及饲料添加剂 5

2.2.2改善养殖水体水质 6

2.2.3疾病的预防 6

3.淡水环境中微生物的培养与观察 7

3.1材料和方法 7

3.1.1实验材料 7

3.1.2实验仪器 7

3.1.3采样时间 7

3.2分析方法 7

3.2.1pH值的测定 7

3.2细菌的培养 9

3.2.1培养基的配置 9

3.2.2平板涂布 10

3.2.3.恒温培养 10

3.3观察培养基 11

3.4细菌的纯化 11

3.5拮抗菌的筛选 13

3.6定量分析 13

3.7实验小结 14

4.展望 17

5.参考文献 18

淡水养殖水体中微生物的初步分离及定量分析

何浩然

，China

Abstract：

Microbiology is an important branch of Earth's life science and plays a pivotal role in human life and changes in the natural environment. The types of microbial metabolism are varied and the growth rate is amazing. As a renewable resource, they have a rich genetic database. In this paper, bacteria were extracted from the water bodies of several different cultured freshwater animals taken from the aquarium, and quantitative bacteria analysis (QPCR) was performed on several bacteria that had grown predominantly after purification to determine their abundance. From the same aquarium aquaculture seawater and natural water bodies of Nanjing University of Information Technology Xiyuan River, the bacterial microecological differences of aquaculture water from different sources were analyzed. The analysis showed that the total amount of bacterial colonies in several types of water: aquaculturegt; Xiyuan Rivergt; cultured freshwater; quantitative analysis of the dominant bacteria selected showed that the number of bacteria in freshwater aquaculture water was 1-6 orders of magnitude lower than that in mariculture water. This shows that in seawater and freshwater aquaculture water, bacterial composition is different, which may be due to differences in salinity in the environment. This provides a theoretical and experimental basis for the subsequent screening of microbial agents that are beneficial to farmed animals.

Key words：

Microbies， Bacteria， Purification， Aquarium， Quantitative analysis

1.前言

1.1研究背景

微生物学是地球生命科学的重要分支，相较于其他学科开展较晚，然而微生物资源在人类生活以及自然环境的变化中却有着举足轻重的角色。微生物代谢类型多样，生长繁殖速度惊人。同时微生物作为一种可再生资源，有丰富的遗传基因库。微生物分布在地球上包括动植物、土壤、湿地、海洋、淡水湖泊和极端环境等领域内，不同环境的微生物生长代谢途径具有差异性，成为地球各圈层中物质与能量迁移转化的最重要载体之一。地球表层部分有将近75%被海洋、湖沼、河流及冰川等水体覆盖，再往下一层的岩石圈中，甚至还有我们现在正在大量开发的地下水资源，前面所提及的水分大气层中的水分共同构成了一个连续而不规则的圈层，即所谓的水圈。拥有地球面积近7成以上的海洋，不仅具有丰富的生物多样性，而且是具有巨大潜力的微生物的来源。海洋环境包括植物，动物和微生物等多种群落，海洋微生物群落包括细菌、真菌、病毒等因其在生物技术过程中的表现而在海洋环境中具有多项优势。海洋环境蕴含巨大的微生物潜力，真菌、动植物是丰富的生物多样性来源，具有从海洋来源提取酶的能力。海洋环境中的微生物拥有独特的生活环境和栖息地遗传特性相比，海洋环境具有极高的化学条件，包括高盐度、高压、低温、稀营养和特殊照明条件。不同栖息地的海洋微生物可以栖息各种各样的微生物，包括古细菌、蓝细菌、真细菌、放线菌、酵母、丝状真菌、微藻类、藻类和原生动物。反观淡水环境，虽然没有像海洋那样相对独特的高盐度和高压的独特微生物生活条件，但是仍然栖息着大量的微生物群落。地下水、自流井和泉水中所含的菌数少，湖泊、河流和池塘的水体中含有较多的微生物。淡水微生物的微生物的数量与人类活动也有密切的联系。人口聚集区域的河流，湖泊和池塘中的含菌量高，每毫升水中可达几千万甚至几亿个；远离人口的聚集区域的微生物的含量低，每毫升水中只有几十个到几百个细菌。

1.2研究现状

淡水环境对于研究人员来说拥有相较于海洋环境更易取样易培养等优势，近些年来淡水环境微生物的研究也取得一定进展。美国联合生物能源研究所研究人员分离了一种在热带雨林土壤中发现的肠杆菌属细菌（SCF1）^[1]这种细菌内部存在一种特殊的酶，能够让木质纤维素更容易被消化，生物燃料的制作量产需要繁多的工序和冗杂的化学预处理，而这样投入使用细菌就能极大地使得生物燃料的产量得到提高。一些厌氧微生物，在对原油驱油领域有很大的应用。对于原油里的内源微生物，厌氧菌可以吸附在原油表面，以原油为碳源，对原油“啃噬”、降解原油；微生物代谢产生的二氧化碳等物质溶解于原油，成为混相，可增加油气混合液的气油比，降低原油黏度改善原油的流动能力；微生物代谢产生的表面活性物质，能降低油水界面张力，乳化原油，改善油、水流度比，同时可吸附在孔隙介质表面发生润湿反转，增强原油的流动性^[2]。在酶的领域，微生物也发挥着巨大的作用，在微生物提取酶的技术日益成熟，很多微生物酶已经投入到工业化生产中，葡萄糖氧化酶（GOD）是人类较早期人类在微生物中提取的酶，而目前对其的研究水平已达到基因层面，通过基因技术改造GOD所在菌株中的表达^[3-4]，成功筛选，产酶量化，获得较高收益。GOD在发酵领域工业应用较多，例如生产葡萄酒等酒类制品此外在医疗行业中已成为制造葡萄糖检测传感器的重要酶制剂，食品工业中作为一种常用的食品添加剂，可以延缓细菌生长、延长货物在架时间、预防食物的腐败。另有研究发现还可以运用在农业病原菌防治^[5]方面。随着海洋科学，生物技术和微生物技术的进步，研究人员正在将大部分精力放在识别微生物和提取微生物的生命成分上面。运用微生物的生命活动所带来的正面收益而制作的微生物类产品技术正在在逐渐完善发展。

2.淡水圈微生物的生态效应

自然界的物质处于由无机物转化为有机物，再由有机物转化为无机物的往复循环之中。一小部分微生物（光合生物）属于生产者，是无机物转化为有机物的主人。大多数微生物（非光合生物）依赖植物而生活，是营养物质的消耗者，在消耗有机物的同时转化成无机物，自然界的物质得以重复利用。

2.1淡水圈微生物参与地球生物元素（碳氮硫等）化学循环

碳素是构成生命体的基本元素，在自然界的蕴藏量极为丰富，但是植物仅能利用二氧化碳。而二氧化碳的贮存量仅占空气容量的0.03%，如果没有补充，在25至30年内就会被植物用尽。空气中的二氧化碳从未减少并始终保持平衡，应该主要归功于微生物对有机物的不断分解，使二氧化碳得以不断地补充。

生物有机体合成细胞物质时，必须有氮参加，植物是自养型的，需要无机氮素，可以是铵盐，但主要是硝酸盐。空气中含有大量的氮气，每亩土地上空约有120万吨，够植物用几十万年，地球上有机氮的储存量约200到250万亿吨，但植物不能直接利用。植物要利用氮气，就得通过微生物的固氮作用；要利用有机氮，就得通过微生物对有机氮的矿化作用。

自然界中存在着大量的硫元素和有机硫化物。元素硫可以被某些细菌（如硫化菌）氧化成硫酸，再生成硫酸盐。一部分硫酸盐被植物吸收利用，合成含硫的氨基酸和蛋白质。另一部分被土壤微生物还原成硫化氢。硫酸盐还原成氨基酸或者氨基酸分解所生成的硫化氢对生物有毒，累积过多会危害动植物，甚至引起死亡。但硫化氢能被某些微生物氧化成元素硫。在许多国家和地区的污水处理厂中，对于类似于“硫”这类有害的元素，通常都能利用大量厌氧微生物在强力通气的情况下对污水进行下一步的净化，称为二级生物处理。

2.2微生物在水产养殖业中的应用

随着海洋遭到污染的情况刻不容缓和ElNINO气候现象连锁带来的气候异常变化,海洋渔业资源正在逐步衰退，迫使我国水产养殖的产量将主要依靠淡水环境养殖来维系。近些年来人们发现保持渔业养殖水环境健康的化学制剂已经带来不小的负收益，对于相对绿色安全的其它添加剂的需求量越来越大。微生物添加剂在此条件下应运而生。

2.2.1饲料及饲料添加剂

微生物饲料是指含有微生物菌体和代谢产物的饲料添加剂^[6]，主要有酶制剂、真菌添加剂等。利用微生物对相关物质进行分解和转化改造，更易让水中生物消化吸收利用，通过增加微生物蛋白质提高饲料的营养价值。单细胞蛋白和噬菌体蛋白是其中的主力军，指大量生长的微生物菌体或其蛋白提取物。单细胞蛋白所含营养物质丰富。蛋白质含量高达40%~80%，氨基酸较为齐全，还含有多种维生素，碳水化合物，脂类，矿物质以及丰富的酶类和生物活性物质，如辅酶A、辅酶Q等。这其中光合细菌和酵母菌的运用最为常见。酵母菌由单细胞构成，其细胞内部含有丰富的蛋白质、维生素、多糖和脂质。有研究表明酵母菌中含有植物胰岛素，该胰岛素可以让所养殖鱼类的进食能力提升，从而整体增大鱼群的产量。例如，在饲料中添加红酵母可使得鳟鱼,鲑鱼的鱼肉肉质提升质量,同时还可以令其皮肤的外观颜色增加光泽富有活力^[7]。光合细菌是能光能自养微生物的一种,能够进行光合作用，含有丰富的菌体蛋白、维生素、磷、钙和多种微量元素,尤其是高辅酶Q₁₀、维素B₁₂等生理活性物质含量较高。因其较高的营养价值和相对全的营养成份,它可以作为鱼虾贝类养殖中良好的饲料添加剂.在泥蚶人工育苗中,以单胞藻为基础饲料,每千克中添加25mg的光合细菌,泥蚶D型幼体与对照池相比变态提前1d,个体增大,突变率提高12%^[8]，白地霉营养丰富,其精制干粉含水18.6%,在干物质中粗蛋白占50.7%,粗脂肪占3.6%,粗纤维占4.7%,粗灰分占13.9%,因此可作鱼类的蛋白质饲料。

2.2.2改善养殖水体水质

某些细菌可利用水中的氨氮、H₂S等化合物,通过自身的代谢，使水中的有毒物质转化为无毒无害的物质,防止水体富营养化,增强水的透明度,从而改善水质。朱后华等池泼洒光合细菌,鱼池水质明显好于对照池^[9]。另外一方面，对于外源毒素（比如农药），会因降水等气候现象进入养殖水体，从而污染养殖类生物的环境。现已发现很多微生物，如无色杆菌属，棒状杆菌属，诺卡式菌属，青霉属等微生物都能分解农药，常见的农药氯丹，DDT在正常环境下被分解的时间大约为11年和3年左右，而在微生物的参与下，分解时间分别为3周和1周，极大的降低了有害毒素对养殖水体的污染，使得虾鱼类的食品安全得以保障。

2.2.3疾病的预防

养殖水体中的鱼类虾类蟹类等会因自身免疫力较低或者因为环境的变化而感染病原菌，为了水体中生物的健康养殖，目前养殖水体中常常会定期投放微生物疫苗，疫苗在淡水环境养殖产业中的应用已经颇具效果,尤其是鱼用疫苗,开发利用前景十分广阔。鱼用疫苗在养殖水体生物中，会在其参与完成代谢后排出鱼类体外，不会在鱼体内残留，这相对于传统的抗生素预防疾病来说是一项几乎无法超越的优点，疫苗既不会使得鱼类产生耐药性，同时在鱼肉质中不会含有抗生素，让消费者们能够吃到更加健康的食品。但是鱼用疫苗的运用还未达到抗生素那样成熟的阶段，当养殖水体的环境发生改变时，如水体的温度发生变化，水体质量发生变化，以及像北方季节性的变化，可能会使一部分鱼用疫苗失活，而没有任何效果，因为有些疫苗的成本较高，失活无疑是对水产养殖户的巨大经济损失，这样鱼用疫苗的安全性也无法得到百分之百的保障，对该疫苗行业的发展也是不小的冲击。Dorson^[10]指出,疫苗的免疫效果是相对的,而不绝对的。因此研究影响鱼类免疫应答的因素是合理有效地应用疫苗,提高免疫效果的一个重要方面,基于这个出发点，目前的研究重点就应该放在研究疫苗、机体与环境三位的互相联系上，让鱼用疫苗的正面收益更高。

本文对采自大厂炫彩水族馆养殖水族箱与西苑河流的淡水水体进行了细菌的提取和纯化，并对其中的优势细菌进行了定量分析，以判断其中的优势菌群。目的是通过对养殖鱼类水体环境的细菌分析，了解健康水体环境中的微生物组成和丰度，为后续筛选有益于鱼体生长的微生物制剂提供参考。同时，还与采自炫彩水族馆的海水水族箱水体中的细菌进行了对比，用以比较淡、咸水环境下细菌的组成是否存在差异。

3.淡水环境中微生物的培养与观察

3.1材料和方法

3.1.1实验材料

海水样本(大厂炫彩水族馆)、淡水样本（大厂炫彩水族馆、西苑河流）

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