论文总字数：28369字

摘 要

本课题选取四环素（tetracycline，C₂₂H₂₄N₂O₈）和磺胺甲恶唑（SMZ，C₁₀H₁₁N₃O₃S）作为研究对象，湿地模型采用小型潜流湿地，内填充黄沙，上种植水芹。主要探究用传统人工湿地及人工湿地耦合微生物燃料电池技术去除水体中抗生素的影响因素及其降解机理，在研究人工湿地对抗生素去除效果的同时，对抗性基因的产生、时空分布规律进行初步探究，对比两种类型湿地内抗性基因的变化情况。

充分利用MFC和人工湿地对难降解有机物降解性能分别具有的优势，并对两者进行有机融合，在上向流人工湿地中构建微生物燃料电池。首先采用活性炭层等作为人工湿地下层厌氧和表层好氧环境的充填基质，分别构成MFC的阳极和空气阴极。设置3组CW模型和5组CW MFC的耦合模型。

结果显示，八组模型（3组CW，5组MFC CW）中对于四环素（TEC）和磺胺甲恶唑（SMZ）的去除率都可达到60%以上，微生物燃料电池与人工湿地的MFC CW耦合模型甚至可以达到70%左右。这也有可能是因为实验装置是新搭建的，运行时间较短，基质没有达到饱和状态，系统也没有出现堵塞等问题，使得装置整体运行地比较顺利，从而抗生素的去除效率比较高。即使装置运行才1个月左右，但还是从取得的土壤及水样样品中检测出了抗性基因。也因为时间太短，无法发现抗性基因在湿地模型中不同深度的分布规律。

关键词：抗生素 抗性基因 耐药菌 人工湿地（CW） 微生物燃料电池（MFC）

Dynamic changes of antibiotics and its resistance genes in Constructed Wetlands

Wang Si Jing

Supervised by Song Hai Liang

Abstract：

We choose tetracyclines and sulfamethoxazole as the research object, the wetland model using small subsurface flow constructed wetland, filled with sand, planted cress. Mainly to explore the traditional artificial wetland and artificial wetland coupling of microbial fuel cell technology for removal and degradation mechanism of influence factors of antibiotic in water, the removal rate of antibiotics in the study of artificial wetland at the same time, defend against gene, temporal and spatial distribution of the preliminary inquiry, contrast two types of wetlands in resistance gene. In order to establish a more green, economical and efficient water treatment process for the water environment, the increasingly serious problem of antibiotic drug pollution.

The advantages of MFC and constructed wetland for the degradation of organic pollutants in hard degradation are the advantages of organic fusion and the organic fuel cell in the constructed wetland.. Firstly, the active carbon layer was used as the filling matrix of the anaerobic and aerobic environment of subsurface aerobic wetland, which constituted the anode and air cathode of MFC.. 3 groups of CW and 5 CW MFC were set up.

The results showed that eight groups of model for tetracycline, sulfamethoxazole removal rate reached more than 60%, microbial fuel cell and the artificial wetland MFC CW coupling model of even can reach 70% or so. It is also possible because of experimental device is built, shorter running time, matrix did not reach saturation, system also did not appear to jam, makes the overall operation of the device smoothly, thus antibiotic removal efficiency is relatively high. Even though the device runs only about 1 months, the resistance gene was detected in the soil and water samples. Because of the time is too short, the distribution of the resistance gene in wetland model is not found.

Key words: Antibiotic Resistant gene Resistant bacteria

目录

摘要： 1

Abstract： 2

1 绪论 4

1.1研究背景 4

1.2研究现状 5

1.3去除抗生素的常用方法 5

1.4本文的研究目的和主要研究内容 8

1.4.1课题的研究目标 8

1.4.2本课题的主要研究内容 9

2 实验设计与方法 10

2.1实验方法依据 10

2.2实验具体方案 10

2.3化学药品 11

2.4实验仪器 11

2.5实验步骤 12

2.6.1液相色谱法测定抗生素浓度 14

2.6.2土壤DNA提取步骤 15

2.6.3水样DNA提取步骤 17

2.6.4 ARGs检测 19

2.6.5琼脂糖凝胶电泳 19

2.6.6实时定量PCR(Q-PCR) 19

3 抗生素处理效率与抗性基因产生的影响因素 20

3.1 抗生素的去除效率 20

3.1.1 抗生素浓度的影响 20

3.2抗性基因的检测 25

4 结论与展望 27

4.1 小结 27

4.2 展望 28

致谢 28

参考文献 29

1 绪论

1.1研究背景

最近几年，PPCPs等新型污染物引起了国内外广泛关注。抗生素主要用于治疗人类及动物的疾病，或者作为长期的辅助药物而添加到动物饲料中以预防疾病、 促进动物生长。最常用的抗生素是喹诺酮类、 四环素类、 磺胺类药物、 大环内酯类等。但是，大多数人类和牲畜不能充分吸收抗生素，会直接通过排泄将其排放到环境中。而且PPCPs不能通过传统的污水处理（WWTP）去除，且危害极大，其中抗生素类化合物是最难去除的。

目前，许多地区通过检测证实饮用水水源已被抗生素污染, 给水常规处理工艺是否可以有效地去除水中的抗生素与饮水健康直接相关。虽然至今并没有发现半衰期较长类似于持久性有机污染物的抗生素类化合物，但是因为人类大量、持续、无限制地向水环境中排放，从而造成抗生素 “假持久性”的水环境问题。抗生素会造成化学污染，并存在一定程度的生态毒性，更重要的是，它还可能诱导环境中耐药菌(Antibiotic Resistance Bacteria, ARB)和抗性基因(Antibiotic Resistance Gene, ARG)的产生，从而直接对人类健康造成危害^[1]。医用抗生素在人体内不能完全被吸收利用，而未被吸收的部分会残留于胃肠道内，并能够诱导微生物产生抗生素抗性从而形成抗性菌株，这些抗性微生物会随粪便一起排出体外，通过水平基因转移等作用使得水环境中土著菌获得抗生素抗性基因，这些携带抗生素抗性基因的污水最终汇入城市污水处理厂，使得城市污水处理厂处理的污水中含有大量的抗生素抗性基因。除了抗生素作用外，越来越多的研究发现，重金属、耐药菌的多重抗性、药物、有机物质、营养物质等因素都会影响环境中抗生素抗性基因的产生。微生物菌群中重金属和抗生素抗性基因的抗性可能是协同作用下产生的。

在医用抗生素方面，我国与欧美等发达国家不同，他们对抗生素的使用有着成熟的控制机制，也不像其他第三世界国家使用抗生素的水平较低。在世界范围内，人均年消费药物量约为15g，而我国每年人均消费抗生素量已经超过了100g。据2006-2007年度卫生部发布关于全国细菌耐药监测的结果显示，全国各医院抗生素类药物年均使用率高达74％，相比在美英等发达国家，抗生素使用率大约为22%～25%。另外根据1995～2007年全国疾病的分类调查中，感染性疾病占全部疾病的49％，细菌感染性占所有疾病的18%～21%，即80％以上属于滥用抗生素问题，且因为此类问题导致每年大概有8万人死亡，这些结果使我国成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一。在兽用抗生素方面，由于我国是个农业大国，畜牧业和水产养殖业规模庞大，每年的养殖废水和畜禽粪便产出也达到了一个惊人的数字。因此，在污水处理厂的二级处理环节中去除抗生素化合物显得尤为重要。

1.2研究现状

长达一个多世纪，药品和个人护理用品（PPCPs）都是毫无限制地排入水生环境中。传统的污水处理厂（WWTPs）能高效处理某些化合物如布洛芬与水杨酸，但是不能有效去除其他的化学物质如卡马西平、氯贝酸等。对三级处理（如臭氧高级氧化技术）进行了评估，发现其可以增加PPCP去除率，但是额外处理的同时也增加了运行成本。因此，需要对排入水面、地面以及沿海水域的处理过的污水进行PPCPs浓度检测，并且在丹麦的PPCPs的环境风险评估中表明它们的浓度可能会超过预测的无效浓度（PNEC）。

PPCPs不能通过传统的污水处理厂（WWTP）去除，且危害极大，其中抗生素类化合物是最难去除的。Westerhoff等^[2]以硫酸铝和氯化铁作为混凝剂，能够去除的红霉素仅为33%。Adams等^[3]采用铝盐和铁盐作为混凝剂研究混凝对7种抗生素的去除效果，试验显示抗生素的去除率仅为5%左右。Dodd等^[4]考察了自由氯和二氧化氯对城市污水和饮用水中抗生素类药物的降解效果，结果发现，自由氯可以较快的降解磺胺噻唑，二氧化氯可以有效的去除大环内酯类和磺胺类抗生素，但这两种方法都会产生毒性较强的亚氯酸盐。此外，抗性基因是也一种难降解有机物，能够随耐药菌进入环境中。它可以稳定存在于一般的环境条件下。而且就算携带耐药基因的菌株死亡，死亡后的菌株释放出的耐药基因分子也能在环境中长期存在。因此，土壤和水体会逐渐成为耐药性基因的储存库，同时也是耐药性基因扩散的介质。再加上耐药基因能以R 质粒、整合子等转移元件为载体在不同种属的微生物间传递和扩散，因此，耐药基因在自然环境中迁移、分布的方式会更加的广泛和多样化。

1.3去除抗生素的常用方法

污水中抗生素的处理方法主要有物理法、化学法和生物法三类。

物理法主要有活性炭吸附法、砂滤法和膜过滤法等，这些方法的原理主要是通过吸附、离子交换等作用将污水中的抗生素浓度降低。

(1)活性炭吸附法：是一种较为成熟的物理方法，无副产物、能耗低、可重复利用。Nowotny等^[5]以及Ternes等^[6]的研究表明，活性炭浓度与抗生素的去除效果具有一定的正相关性。但是活性炭吸附法成本较高，而且会产生二次污染，因此一直没有被广泛使用。

(2)砂滤法：随着过滤器技术的不断进步，砂滤法也越来越普及。Nakada等^[7]采用砂滤法对抗生素废水进行处理，发现该法对抗生素的去除效果低于50%，由此可见，砂滤法的去除效果一般，不适合用于处理污水中的抗生素。

(3)膜过滤法：膜分离方法^[8]经常用于抗生素废水的浓缩和分离。主要分为反渗透、超滤和纳滤，作用原理为对分子的截留。Yoon等^[9]通过纳滤和超滤方法去除PPCPs时发现，膜过滤法对部分PPCPs的去除效果好，且研究表明膜孔径与抗生素去除率之间有一定的相关性。和活性炭吸附法一样，该方法的成本也较高，因此在抗生素废水处理中应用不多。

化学法主要有混凝沉淀法、化学氧化法等。

(1)混凝沉淀法：混凝沉淀^[10]是处理抗生素废水较多的一种处理方法，且运行成本合理有一定的应用价值。张鑫^[11]的研究发现，该法对部分抗生素去除率在40%左右。Suarez等^[12]的研究表明，絮凝剂可以使PPCPs的去除率提高4%~13%。但该法对抗生素整体处理效果一般，可作为污水前处理工艺。

(2)化学氧化法：氧化技术是处理含有高浓度难降解有机物的废水的一种有效手段，可利用高级氧化技术处理抗生素废水，而且去除BOD、COD的效率都很高，但出水中往往会残留有的大量Fe² 和Fe³ ，对后续的生化处理十分不利，出水一般需采用Ca(OH)₂将废水调节至碱性条件，然后再用混凝沉淀法进行处理。化学氧化法去除抗生素化合物的效果较好，而且具有较强的针对性，但是此方法会产生具有生物毒性的中间产物，并且处理成本较高，所以也无法推广为抗生素的最佳处理方法。

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