量子点通过P38-MAPK信号通路引起的氧化损伤及该通路抑制的研究

论文总字数：17044字

摘 要

：目的 探讨硫化氢(H₂S)是否可以通过抑制P38-MAPK信号通路的激活，减少两种粒径（2.2 nm 和3.5 nm ）CdTeQDs引发的L929和NIH3T3细胞的氧化损伤。方法 使用两种粒径不同浓度的CdTe QDs对L929和NIH 3T3细胞进行染毒，蛋白免疫印记法(Western Blot)检测上述两种细胞内P38-MAPK信号通路的激活；利用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测单独作用组：终浓度为0（对照）、50、100、200、400、700、1000 μmol/L的NaHS（H₂S供体）溶液对L929和NIH 3T3细胞培养12 h 、24 h , 联合作用组：0(对照)、400 μmol/L NaHS、80 μg/ml QDs、400 μmol/L NaHS 80 μg/ml QDs，对L929和NIH 3T3细胞进行染毒后，两种细胞增殖活性的改变；利用DCFH-DA法检测联合作用组中两种细胞内活性氧(ROS)的产生情况；利用Annexin-V-FITC检测联合作用组中两种细胞凋亡率的改变。结果 CdTe QDs染毒24 h 后，P38-MAPK信号通路被激活，与阴性对照组相比较有统计学意义（Plt;0.05），且呈现出剂量依赖关系；再用80 μg/ml CdTe QDs处理L929和3T3细胞前60 min ,用400 μmol/L NaHS预处理后，P-p38表达降低，细胞存活率增高，细胞内ROS水平及凋亡发生率降低，与同剂量未用NaHS预处理的实验组结果比较，差异有统计学意义（Plt;0.05）。结论 硫化氢(H₂S)可以通过抑制P38-MAPK信号通路的激活，减少两种粒径（2.2 nm 和3.5 nm ）CdTeQDs引发的L929和NIH3T3细胞的氧化损伤。

关键词；量子点; CdTe; P38-MAPK信号通路；氧化损伤；硫化氢

Study on the oxidative stress caused by quantum dots through activating P38-MAPK signal pathway and the inhibition of this pathway

Abstract: Objective To investigate whether H₂S could inhibit the activation of P38-MAPK signal pathway, helping reduce the oxidative stress of the cells (L929 and NIH 3T3) caused by CdTe QDs with two different grain sizes (2.2nm and 3.5nm). Methods Using western blot to test the activation of the P38-MAPK pathway after treated by QDs and H₂S in cells. MTT was applied to test the proliferation activity of cells after treatment while DCFH-DA assay was applied to test the ROS in cells and Annexin-V-FITC assay was used to test the rate of apoptosis of cells. Results After treated by CdTe QDs for 24 hours,P-38 MAPK pathway was activated（Plt;0.05）and dose-related with QDs. Before treated with CdTe QDs in 80μg/ml, cells were treated with NaHS in 400μmol/L. The expression of P-p38 decreased while survival rate of cells increased and ROS in cells raised（Plt;0.05）. Conclusion H₂S could inhibit the activation of P38-MAPK signal pathway, helping reduce the oxidative stress of the cells (L929 and NIH 3T3) caused by CdTe QDs with two different grain sizes (2.2nm and 3.5nm).

Key words： quantum dots; CdTe; P38-MAPK signal pathway；oxidative stress；H₂S

量子点(quantum dots,QDs)，又称为半导体纳米晶体，是指直径从2-100nm的纳米晶体。它是由金属内核，以及可以提高核心光学和电子特性并且减少金属浸出的外壳构成^[1]。由于其优异的荧光学性能，使其有望取代有机荧光染料，而广泛应用于生物医学领域^[2]。但与此同时，量子点的生物安全性也日益受到了关注。有研究表明量子点可以通过激活MAPK信号通路，引起细胞的氧化损伤从而诱导细胞的凋亡^[1]。近年来，硫化氢(H₂S) 被认为是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后第三种“气体信号分子”^[3]，其保护作用的一个最重要的机制就是它的抗氧化作用，清除超氧化物阴离子、过氧化氢（H₂0₂）^[4]和过氧亚硝基^[5],抑制氧化应激。本实验将以P38-MAPK 该条细胞凋亡通道作为研究对象，探索H₂S是否可以通过该条通路来防止CdTe QDs在L929和NIH 3T3细胞中引发的增殖抑制作用，ROS的形成以及细胞凋亡的发生。

1 材料与方法

1.1实验材料

CdTe(粒径2.2 nm 和3.5 nm ，分别发绿色与红色荧光，发射波长为547 nm 和622 nm )。实验前，将CdTe QDs溶解并且均匀分散于无血清培养液中，再使用0.22 μm 滤膜抽滤，冰箱4 ℃ 保存备用。

1.2实验细胞

L929(小鼠成纤维细胞)、NIH 3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)(中国科学院上海细胞生物研究所)。

1.3试剂

1.3.1 Western blotting

RPMI-1640培养基、DMEM培养基（美国Gibeo公司）；

胰蛋白酶溶液（美国Difco公司）；

新生小牛血清、新生胎牛血清（杭州四季青公司）；

磷酸盐缓冲溶液（PBS，博士德生物工程有限公司）

表1 WB相关试剂

名称	生产或销售厂家
Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology, Inc.
SAPK/JNK (56G8) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology, Inc.
Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (D3F9) XP® Rabbit mAb	Cell Signaling Technology, Inc.
p38 MAPK (D13E1) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)	Cell Signaling Technology, Inc.
Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb	Cell Signaling Technology, Inc.
Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology, Inc.
GAPDH	Cell Signaling Technology, Inc.
预染蛋白Marker SM0671	Fermentas
BCA蛋白质定量试剂盒、	碧云天公司
ECL化学发光底物	Pierce
Roche蛋白酶抑制剂	罗氏公司
PVDF膜	罗氏公司
30%丙烯酰胺，BSA，Tween20	南京生兴生物技术有限公司
6×loading buffer	南京生兴生物技术有限公司
RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)	碧云天公司

WB试验其他需自己配置的试剂：

(1)10×TBS

NaCl 88 g，Tris 79 g，调PH值至7.5，用蒸馏水定容至1 L ，常温保存。

(2)TBST缓冲液

使用时稀释到1×，每1 L 加500 μL 的Tween20，即为含0.05 % Tween20的TBS缓冲液。

(3)10 % 过硫酸铵

过硫酸铵1 g ，加去离子水，定容至10 mL ，平均分装成10管，－20 ℃ 保存。

(4)10 % SDS

SDS 10 g ，蒸馏水至100 mL ，50 ℃ 水浴下溶解，室温保存。

(5)5×Tris−Glycine Buffer (SDS−PAGE电泳缓冲液)

Tris 15.1 g ，甘氨酸94 g ，10 % (W/V)SDS 50 mL ，加约900 ml 去离子水搅拌溶解。定容至1 L ，RT保存。

(6)10×Transfer Buffer (SDS−PAGE转移缓冲液)

Tris base, 30.25 g ，glycine(甘氨酸)112.5 g , 定容至1 L ，4 ℃ 保存。

(7)1×Transfer Buffer (1L)

100 mL 10×Transfer Buffer，溶解于700 ml 去离子水，定容到800 mL ，再加入200 mL 甲醇。

(8)封闭液(含5 ％ 脱脂奶粉的TBST缓冲液)

脱脂奶粉0.5 g ，溶解于配置好的TBST溶液中，4 ℃ 保存。

1.3.2 MTT实验

MTT(全称：溴化-3(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑，美国 Sigma 公司)，溶液配制：称取MTT 50 mg ，加10 ml PBS在磁力搅拌器上搅拌30 min ，使用微孔滤膜抽滤，分装，-20 ℃ 保存备用；

NaHS(H₂S的供体)、二甲基亚砜(DMSO)、SB 203580(P38 抑制剂)(美国Sigma公司)；

1.3.3 DCFH-DA试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)的产生

凯基细胞活性氧含量检测试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)；

NaHS（H₂S供体）：（购买于Sigma公司）用无血清培养基溶解，配制成1000 μmol/L母液，-20 ℃ 保存，使用时根据预实验结果，用无血清培养基稀释到400 μmol/L；

SB 203580(P38 抑制剂)(美国Sigma公司);

1.3.4 Annexin-V-FITC试剂盒检测细胞内细胞凋亡率的改变

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物科技发展有限公司）；

NaHS（H₂S供体）：（购买于Sigma公司）用无血清培养基溶解，配制成1000 μmol/L母液，-20 ℃ 保存，使用时根据预实验结果，用无血清培养基稀释到400 μmol/L；

SB 203580(P38 抑制剂)(美国Sigma公司)。

1.4 仪器

1.4.1 Western blotting

全自动酶标仪(Mithras LB940,德国Berthold公司);

CO₂培养箱(Thermo Scientific Series 8000 −3423, 美国Thermo Scientific)；

倒置显微镜(CKX41，Olympus公司)；

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