环境雌激素活性检测

论文总字数：9330字

摘 要

探讨环境化合物雌激素活性的检测方法及其联合作用的评定方法。 方法 将MCF-7细胞作为受试生物，测定E2、TAM及二者固定浓度比混合后的混合物对MCF-7细胞增殖的影响，基于单一化合物的剂量-反应曲线，运用浓度相加(CA)模型和独立作用(IA)模型对二元混合物的作用进行预测，并将模型预测结果与混合物作用的实验数据进行比较分析。结果 E2在0.1pM-10μM范围内随着浓度的增高，MCF-7细胞的增殖效应逐渐增高，剂量效应关系曲线呈S型，在1nM达到最大增殖效应；TAM在0.1pM-10μM范围内增殖效应与TAM浓度呈反相关；二者等浓度比例混合物在0.1pM-10μM范围内的作用存在低浓度抑制、高浓度先促进后抑制的细胞增殖现象，在混合物浓度分别为0.1nM和10μM时达到最低效应；CA模型与IA模型预测曲线与由混合物实验数据得到的曲线均有很大差别，说明二化合物间存在交互作用，无法直接应用模型预测。结论 TAM对雌激素效应有一定的抑制作用，但无法通过不能表达交互作用的CA模型与IA模型进行预测，需进一步探讨。

关键词： 雌二醇；他莫昔芬；MCF-7细胞；雌激素活性；联合作用；预测模型

Detection of environmental estrogenic effects

Abstract：Objective To reveal the assessment methods of environmental estrogen and combined estrogenic effects , Methods the MCF-7 human breast cancer cell line was exposed to tamaxifen (TAM) and natural hormone 17β-estradiol (E2) as well as the mixture of them and the activity inhibition rates was detected. Then based on the concentration-response curves of every single chemical, two models including concentration addition(CA) and independent action(IA) were employed to predict the joint toxicity of the mixtures. The concentration-response curves predicted by CA and IA were compared with the experimental data．Results At the range of 0.1pM-10μM when the concentration of E2 increase , the proliferation effect of MCF-7 cell increased with an S-shaped dose-response curve, and reach maximum multiplier effect at 1nM; TAM-proliferative effect within 0.1pM-10μM concentration was inversely associated with TAM; the mixture showed inhibition of low concentration and showed promotion of high concentration, and reach the minimum effect at 0.1nM and 10μM; CA and IA predictions are very different from the curves obtained from mixture experimental data, which indicate that there was mutual effect between the two chemicals . Conclusions TAM has a certain extent effect at estrogen, but CA and IA can‘t express mutual effect, so it needs further explore.

Key words: 17β-estradiol ; tamaxifen; MCF-7 cell; estrogenic effects；combined effects; predictive model

前言

随着人工合成化学品应用的增加，越来越多的环境雌激素被检测出来。由于易于沿食物链富集和放大，环境雌激素已造成了全球性污染，极大地危害着人类的健康^[1-2]。环境介质中以低剂量存在的环境雌激素（Environmental estrogens）可能通过多种机制表现出联合作用，而现有的EEs研究主要集中于单个化合物，无法阐明不同EEs同时存在时带来的危害。目前对环境雌激素联合作用的研究大多为同种EEs联合作用的研究，不同种EEs联合作用的研究基本处于空白状态。因此，亟需环境雌激素与抗雌激素的联合作用的研究^[3]。

MCF-7乳腺癌细胞增殖实验广泛地应用于环境雌激素的体外检测，具有快速简便、灵敏度高、可以同时检测多种环境雌激素等优点^[4]。由于MCF-7细胞使用方便而且易于获得，目前也被广泛应用于乳腺癌研究领域^[5-6]。

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率有上升的趋势^[7]。乳腺癌是雌激素依赖性肿瘤，内源性激素雌二醇（E2）对乳腺癌的发生发展起着最重要的作用，因此研究雌激素活性的检测方法具有重要意义。雌激素受体（ER）是大多数乳腺癌和决定其细胞生长和内分泌反应的靶基因的明确和促进的转录因子^[8]。他莫昔芬是一种治疗乳腺癌的药物，是通过与雌激素竞争雌激素受体以达到治疗乳腺癌的作用。

本课题选用MCF-7细胞增殖实验探讨雌二醇、他莫昔芬对MCF-7细胞增殖的单独效应及二者联合作用的剂量效应关系，结合相关的数学模型，全面细致地分析所得结果，对于及早发现环境雌激素并评价其危害以及评价抗雌激素药物的效果具有理论意义和实用价值。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1细胞来源及培养 由南京大学生命科学学院药理教研室惠赠。

在37℃，5% CO2，饱和湿度的条件下，将细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中选用开放式单层贴壁培养。加受试物前48h（4d）用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后在含5% CDT-FBS的无酚红DMEM培养液中培养。

1.2主要试剂

DMEM高糖培养基、无酚红DMEM培养基和胎牛血清（FBS）购于Hyclone公司；噻唑蓝（MTT）、17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）和二甲基亚砜（DMSO）均购于Sigma公司，他莫昔芬（tamoxifen，TAM）由上海复旦复华药业提供。将E2 、TAM分别以DMSO为溶剂配制成10mM的高浓度储备液，每次实验时用无酚红培养基稀释至各自实验浓度。

1.3主要器材

所用仪器包括生物洁净工作台、CO2培养箱( Thermo Scientific，USA)，IX2-ILL30倒置显微镜（Tokyo，Janpan），酶联免疫检测仪（Winooski，USA）。

1.4方法

1.1.4无激素胎牛血清的制备 取5g活性炭、0.5g葡聚糖于100mlFBS中在56℃水浴振荡30min之后进行离心，取上清液用0.22μm滤膜过滤， -20℃条件保存备用。

1.4.2 实验分组 用无水乙醇将各受试物溶解后置于-20℃备用。实验前，加入无酚红DMEM培养液（含10% CDT-FBS）中，终浓度如下：

溶剂对照组（DMSO）:体积分数为0.1%；

雌激素组（17β-雌二醇，E2）:0.1pM～10μM（10倍浓度差）；

抗雌激素组（TAM）：0.1pM～10μM（10倍浓度差）；

二元等浓度混合物（E2和TAM）：0.1pM～10μM（10倍浓度差）

1.4.3 E2、TAM及其等浓度混合物对MCF-7细胞增殖效应的测定

收集对数期细胞，用含10％CDT-FBS的培养液调整细胞悬液浓度，每孔加入150µl（-200µl），铺板调待测细胞密度为1000-10000/孔（5000个），用无菌PBS填充边缘孔。接种至96孔平底板，置于5% CO2，37℃条件下孵育，培养至孔底铺满单层细胞。细胞贴壁后加入浓度梯度药物（单个化合物和混合物均设置9个浓度梯度，设置5个复孔）； 在5%CO2，37℃条件下继续培养。48h后弃去旧液，每孔加入20µl含MTT的培养液（MTT：培养基=1:9），继续培养4h。终止细胞培养，小心吸去孔内的培养液，每孔加入150µlDMSO，置于摇床上低速振荡10min或吹打15次左右，充分溶解结晶物。选择490nm波长，用酶标仪测定各孔光吸收值（OD值），记录结果，。扣除试剂空白值后进行计算。用校正相对增殖效应( Relativistic Proliferation Effect,RPE)作为评价指标，公式如下：

式中,OD是各剂量组吸光度，OD1是阳性对照组吸光度，OD0是溶剂对照组吸光度。

1.4.4 化合物浓度-反应数据统计处理和分析 采用origin7.5软件对浓度-反应关系进行非线性曲线拟合，选择拟合相关系数R²值最大的函数为最优拟合函数，同时绘制浓度与MCF-7细胞相对增值效应的关系曲线并同时获得其95%置信区间。

1.4.5混合物模型预测效应 通过实验和统计处理测得混合物实际的联合作用效应（实测值），并依据单个化合物剂量-反应曲线，建立相加作用数学模型预测混合物联合作用效应（预测值）。实测值与预测值进行比较，对其相关性进行分析，从而判断混合物的联合毒性作用类型与特点。对TAM和E2等浓度混合物的联合作用进行预测可运用浓度相加（CA）和独立作用(IA)模型。

（1）浓度相加（CA）模型可用以下公式表示：

（

式中：为混合物中化合物i的浓度占总浓度的分数。（单位：ng/L）为引起效应的混合物预测总浓度。其中（单位：nM）可通过单个化合物剂量–反应回归方程的反函数求得，即：

（2）独立作用（IA）模型可用以下公式表示：

为混合物中各化学物在浓度时所产生的效应，可通过剂量–反应关系方程或内插法计算得到，即：

（

式中：为单个化学物的剂量–效应函数，对于给定混合物效应可通过迭代算法计算。

2结果(Results)

2.1 E2单独作用的MCF-7细胞增殖效应

运用非线性回归方法对E2的MCF-7细胞增殖实验数据进行非线性曲线拟合，并将多个函数拟合的曲线进行比较。结果显示，E2的浓度-效应曲线是二参数的Weibull函数拟合度最优，拟合的曲线如图1所示，其方程参数和决定系数列于表1。

图1 E2单独作用的浓度-反应曲线

Fig. 1 The concentration-response curves of E2

表 1 E2单独作用的浓度-反应关系曲线方程的参数和EC50值

Table 1 Concentration-response parameters, EC50 value of E2

化合物	方程参数		R2	EC50(nM)
	β1	β2
E2	2.26531	1.66078	0.97322	0.026

Weibull方程及其反函数方程为:

式中，ECx为发生x效应的化合物浓度；β1、β2为模型参数。

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