纳米银在大鼠体内的分布研究

论文总字数：8447字

摘 要

研究不同粒径纳米银大鼠体内血和脏器分布等体内行为，阐明纳米银粒径与体内过程的关系 研究方法：分别在染毒后6h内（5min，10min，20min，30min，1h，2h，4h，6h）取大鼠血液，在6h，1d，7d，14d时取大鼠脏器标本，通过ICP-MS检测银含量。结果：两组纳米银染毒组血银水平在1 h内均呈快速下降趋势，1 h ~ 6 h维持稳定，稳定时血银水平AgNPs-100组高于AgNPs-20组。大鼠体内分布研究表明，尾静脉注射纳米银后，在脑,心,肺,肝,脾和肾各主要脏器中均可检测到不同水平的银。染毒1 d时，AgNPs-20主要分布在肝脏和脾脏，AgNPs-100主要分布在肺脏，AgNO3主要分布在肝脏；染毒14 d时，两纳米银组的主要分布组织均为肝脏和脾脏。结论：AgNPs-20更易于从血液中分布进入脏器，主要分布于肝脾，AgNPs-20主要分布于肺肝脾。

关键词：纳米银，粒径，血液动力学，脏器分布

Study on the distribution of nano silver in animal body

Abstrect: Objective:to study the different sizes of silver nanoparticles in rat blood and organ distribution in vivo, clarify the relationship of silver Nanoparticle size and body processes. Methods: testing rats blood within 6 hours (5min,10min,20min,30min,1h,2h,4h,6h, respectively) after exposurein, detecting the siliver content in 6h,1d,7d,14d rat organ specimens by ICP-MS.R esult: two groups of silver Nano-Silver levels infected blood showed a rapid decline in 1 h, 1 h ~ 6 h maintained a steady, when its stable,blood levels of silver AgNPs-100 group higher than in the AgNPs-20 group. Distribution in rats show that after the tail vein of silver nanoparticle, in the brain, heart, lungs, liver, spleen and kidneys all the main organs can be detected by different levels of silver. When exposed to 1 d, AgNPs-20 mainly in the liver and spleen, AgNPs-100 mainly in the lungs, AgNO3 are mainly located in the liver; When 14th d exposure, two Nano-AG the leading distribution organizations are the liver and the spleen. Conclusion: AgNPs-20 easier to distributions from the blood into the organ, mainly be finded in the liver and spleen, AgNPs-20 mainly in lung and liver and spleen.

Keywords: silver nanoparticle, particle size, hemodynamics, distribution of organs

纳米科学技术被公认为是2l世纪支撑人类进步的三大核心技术（生命科学技术,信息科学技术,纳米科学技术）之一。它引领人类进入了小尺寸,大世界的新时代——纳米科技时代。随着纳米技术的发展，越来越多的人工纳米材料和纳米产品被运用于人类生活的方方面面。纳米技术在给社会带来可观经济收益和技术进步的同时，纳米材料对于人类的健康危害也越来越引起关注^[1-5]。

纳米银由于优异的抗菌性能，在卫生,保健,医学等领域已得到广泛应用^[6]。研究纳米银进入体内后生物毒理学效应及其体内动力学行为对于纳米产业的健康可持续发展具有重大意义。相对于纳米银应用方面的研究资料而言，总体而言，目前对于通过各种途径进入人体的纳米银所产生的生物学效应的研究尚不充分，主要体现在对纳米银的体内暴露毒性了解不够深入，以及对纳米银在体内的吸收,分布,转运,代谢,排泄和蓄积的情况了解不足。因此有必要进一步开展纳米银的体内生物效应研究以及相关的体内生物动力学研究。研究纳米银在大鼠体内的分布，有利于进行进一步的代谢动力学和研究，是纳米银毒性评价的依据和基础。

电感耦合等离子体质谱（Inductively Coupled Plasma – MassSpectrometer，ICP-MS）是一种测量溶液中微量元素含量的有效技术，使用 ICP-MS技术测量Ag含量，检出限可以达到1ng/L。因此在研究中采用此技术测试动物脏器组织,血液中银含量。本课题组之前的研究中选择了AgNPs-20作为实验对象，研究纳米银对小鼠的急性毒性，染毒剂量为120 mg/kg^[7]，本研究在用该剂量进行预试验的时候，发现染毒后大鼠状态良好，无明显毒性体征，因此沿用该剂量染毒。AgNPs-20材料标示银含量为25%，以银含量计，染毒浓度为30 mg/kg；AgNPs-100材料标示银含量为99.5%，设染毒浓度为30 mg/kg。

1. 材料与方法
   1. 试剂和仪器

20nm纳米银（AgNPs-20）粉体（标示银含量为25%，上海沪正科技有限公司）；100nm纳米银（AgNPs-100）粉体（标示银含量为99.5%，美国Sigma公司）；优级纯65%硝酸（国药集团化学试剂有限公司）；优级纯30%过氧化氢（自国药集团化学试剂有限公司）；Ag标准溶液（国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院）；NexION 300X型电感耦合等离子体质谱仪（美国PerkinElmer公司）；JEM-2100型透射电镜（TEM，日本JEOL公司）；S-4800扫描电镜（SEM，日本日立公司）。

• 1. 纳米银材料表征

将配置好的的纳米银染毒液，滴在铜网上，分别用TEM和SEM检测，并使用Nano Measurer 1.2.5软件统计纳米银粒径分布。将配置好的纳米银染毒液放入石英器皿中使用粒度仪进行粒度检测。

• 1. 实验动物

清洁级SD大鼠24只，雄性，约300 g，购自南京市江宁青龙山动物繁殖场（动物许可证号：SCXK（沪）2012-0006）。饲养于东南大学医学院实验动物中心清洁级动物房内，每笼3只，每周更换2次垫料，可自由进食标准饲料和饮用灭菌去离子水。严格控制饲养环境：温度（22±2）℃；相对湿度（65±10）％；正常通风换气；人工白昼/黑夜每日各12h。

• 1. 纳米银在大鼠血液中的动力学分析

称量100 - 200 mg血液样品（分别在染毒后5min，10min，20min，30min，1h，2h，4h，6h收集），放入锥形瓶中，并加入65%浓硝酸5 ml左右，静置于避光处过夜待用，次日加入2 ml 30%双氧水。将混合物于200℃加热消解直到锥形瓶中的混合液体体积挥发至1 ml左右。随后将剩余液体转移至离心管中，使用2%稀硝酸定容至10 ml左右，待测^[8]。绘制血银水平经时变化曲线，进行分析。

• 1. 纳米银在大鼠体内的分布

称量100 - 200 mg脏器样品（分别在染毒后1d，7d，14d收集），放入锥形瓶中，并加入65%浓硝酸5 ml左右，静置于避光处过夜待用，次日加入2 ml 30%双氧水。将混合物于200℃加热消解直到锥形瓶中的混合液体体积挥发至1 ml左右。随后将剩余液体转移至离心管中，使用2%稀硝酸定容至10 ml左右，待测^[8]。绘制脏器浓度分布图，进行分析。

1. 实验结果
   1. 纳米银材料表征结果

图1 AgNPs-20纳米银形貌图和粒径分布图

A

C

D

B

C

（A: TEM图；B：粒径分析图；C: SEM图；D：水合粒径分析图）

粒径分析结果如图1和图2所示。粒径分析结果可知，AgNPs-20样品基本呈球形，粒径分布从9.41 nm到43.97 nm，平均粒径为21.54 nm，平均水合粒径为43.76 nm。AgNPs-100样品呈椭球形，粒径分布从41.29 nm到158.37 nm，平均粒径为79.04nm，平均水合粒径为952.1 nm

图2 AgNPs-100纳米银形貌图和粒径分布图

A

C

D

B

（A: TEM图；B：粒径分析图；C: SEM图；D：水合粒径分析图）

• 1. 标准银溶液曲线

每次进行ICP-MS检测之前，使用标准银溶液绘制标准曲线。标准曲线各点浓度分别为1，10，20，40，60，80，100 ng/ml，以浓度作为横坐标，ICP计数作为纵坐标，测得相关系数R2gt;0.999。

• 1. ICP-MS参数设定

射频功率：1100W；载气流速：1.2 L/min；冷却气流速：15.0 L/min；辅助气流速：1.2 L/min；雾化室：双通道雾化室；雾化器：十字交叉雾化器；蠕动泵采集转速：20rpm；蠕动泵快速提升转速：48 rpm；蠕动泵快速提升时间：50 s；蠕动泵稳定时间：20s；测量元素：¹⁰⁷Ag。数据采集与处理软件：NexION(Version1.0.1916)。

• 1. 血液银含量w( Ag)

测定各纳米银染毒组大鼠不同时间点血液中纳银的浓度，结果如表1和所示，两组纳米银染毒组血液中的银浓度在1 h内均呈快速下降趋势。AgNPs-20染毒组大鼠的血银浓度在20 min内高于AgNPs-100染毒组，30 min时两组趋于一致，1 h ~ 6 h之间，AgNPs-20染毒组血银浓度呈持续下降，而AgNPs-100染毒组血银浓度基本维持稳定，浓度高于AgNPs-20染毒组。

表1 大鼠染毒纳米银6 h内血液中银含量的变化（x±s）N=3

时间	血液银水平（μg/g）
	AgNPs-20	AgNPs-100
5 min	110.26±12.23	85.30±18.03
10 min	76.81±26.76	59.12±5.90
20 min	48.25±37.36	41.87±11.34
30 min	26.40±18.55	34.03±8.45
1 h	13.51±13.89	28.01±5.98
2 h	1.95±2.08	14.14±5.36
4 h	1.06±1.43	9.66±1.40
6 h	0.30±0.06	8.37±0.51

2.5 脏器和血液银含量

将大鼠按照不同的时间点分组解剖取脏器后，用ICP-MS检测脏器中的银含量。表示不同时间点大鼠脏器银含量。图3分别表示各染毒组脏器银含量。由图表可以发现，大鼠静脉染毒AgNPs-20后，纳米银主要分布在肝脏和脾脏之中，在肝脏中银含量在1d时达到最高，且在14 d内维持较高水平；AgNPs-20在染毒后的14 d内，随着时间的变化，脾脏中银含量在7d 时达到最高，14d时略有下降，依然维持较高水平。14d 时各主要脏器中的银浓度由高到低依次为肝脏gt;脾脏gt;肾脏gt;肺脏gt;心脏gt;脑组织gt;血液。

大鼠染毒AgNPs-100后，在开始6h~1d内，纳米银主要分布在肺脏,肝脏和脾脏之中。随着时间的变化，肺脏中银含量下降较快，而肝脾中的银含量下降缓慢，14d 时各主要脏器中的银浓度由高到低依次为肝脏gt;脾脏gt;肺脏gt;心脏gt;肾脏gt;脑组织gt;血液。

AgNPs-20染毒后大鼠各主要脏器的银含量

AgNPs-100染毒后大鼠各主要脏器的银含量

1. 讨论

AgNPs-100组血银浓度水平维持较高，难以从体内消除。可能原因是AgNPs-100的粒径更大，在经过脏器的时候被截留，而AgNPs-20在1h内血银水平下降很快，在2h-6h达到稳定阶段，比AgNPs-100低很多。可能原因是因为AgNPs-20粒径更小，并且含有PVP包被，水溶性强，更容易分布于脏器中。

本实验发现，纳米银在肝脏、脾脏和肺脏中的分布最多，约是肾脏中银含量的60~100倍。这个现象可能与肺部、肝脏和脾脏中的单核巨噬细胞系统（MPS）有关。有研究表明^[9]，MPS对纳米材料具有一定的吞噬作用，能够清除血液中的异物，对纳米银具有一定的摄取，从而增加了纳米银在肝脏、脾脏和肺脏中的分布。急性毒性试验结果表明，纳米银染毒7 d，大鼠的肝脏具有一定的病理改变，并且肝脏相关的生化指标也发生了改变。结合纳米银在肝脏中的分布，认为肝脏是纳米银主要的毒性作用靶器官。已有的研究表明，通过不同途径染毒纳米银，肝脏都是主要的靶器官^{[10, 11]}。Cha K等[12]通过小鼠口服纳米银，观测到小鼠肝脏淋巴细胞浸润。Takenaka S等^[13]通过吸入方式对大鼠染毒纳米银，通过ICP-MS检测到除了肺部以外，肝脏中的银含量最高。

静脉染毒的纳米银，首先通过心脏进入肺脏，从而进入动脉重新分布入血。由于AgNPs-100粒径更大，可能更多地被截留在肺部，随着时间的推移，至14 d时，AgNPs-100组的脏器银含量的规律与AgNPs-20组类似，均为肝脏和脾脏中银含量最高，认为肝脏和脾脏为纳米银主要蓄积和作用靶器官。

已有的药动学和药效学实验研究表明, 纳米颗粒作为载体能促进药物透过血脑屏障。如杨时成等^[14]对小鼠分别染毒喜树碱硬脂酸纳米颗粒混悬液和喜树碱溶液，结果表明在纳米颗粒混悬液染毒组脑内浓度明显升高。对比相同时间点脑组织的银浓度和血液中银浓度，发现除了染毒 6 h时AgNPs-20组和染毒1 d时AgNPs-100的脑组织浓度低于血液浓度，其他时间点，AgNPs-20和AgNPs-100染毒组脑组织浓度均高于血液浓度。而AgNO3染毒组的脑组织浓度均低于血液浓度，表明纳米银可透过血脑屏障进入脑组织，相关机理有待进一步研究。

1. 结语

根据纳米银在大鼠体内的血液动力学和组织分布情况研究发现，纳米银具有较高的组织亲和力，对于不同粒径的纳米银，脾脏和肝脏可能是主要蓄积作用靶器官，对于粒径较大的AgNPs-100，肺脏也是可能的靶器官对纳米材料体内动力学变化和组织分布的深入研究，有助于探究作用靶器官，为揭示作用机制和安全性评价奠定基础。

参考文献

[1] Walker N J, Bucher J R. A 21st century paradigm for evaluating the health hazards of nanoscale materials?[J]. Toxicol Sci. 2009, 110(2): 251-254.

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